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外泌體的相關(guān)成分:1、外泌體的膜同細(xì)胞一樣,是磷脂雙分子層。2、外泌體膜含有MHC-1/2蛋白,能綁定特異性的肽鏈。3、外泌體膜中有跨膜蛋白PGRL、LAMP1、LAMP2。4、外泌體膜中有膜轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白annexins、RAN、GTPases。5、外泌體膜上有脂質(zhì)筏Chol、ceramide、SM、PC,限制膜流動(dòng),參與包括跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)內(nèi)吞、脂質(zhì)及蛋白定向分選的多種功能。6、外泌體中含有核酸,包括miRNA、DNA、lncRNA、mRNA;同時(shí)還有一些蛋白、脂類(lèi)也能被包裹到外泌體中。7、與外泌體產(chǎn)生相關(guān)的重要分子:Ral、ARF6、PLD2、RAB家族。8、一些物質(zhì)進(jìn)行外泌體中是特異性的:如hnRNPA2B1能結(jié)合lncRNA或miRNA特異性的序列(GGAG/CCCU),進(jìn)行主動(dòng)包埋。外泌體的膜同細(xì)胞一樣,是磷脂雙分子層。外泌體是分泌的細(xì)胞外囊泡的主要群體,是具有生物活性的脂雙層囊泡。腹水提取試劑盒方法
外泌體的提取、純化和鑒定:每一個(gè)外泌體研究者較初都要為外泌體的分離提取而煩惱。選擇的分離方式是利用超速離心的方式分離外泌體,并且可以選用梯度密度離心法得到純度更高的外泌體。另外利用外泌體自身的物理化學(xué)性質(zhì)所研發(fā)的各種市售的外泌體分離提取試劑盒也能達(dá)到分離效果。提取的外泌體的鑒定方式主要是通過(guò)形態(tài)學(xué)、粒子大小以及標(biāo)志蛋白等方式實(shí)現(xiàn)的。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)外泌體在比較多生理病理上起著重要的作用,如免疫中抗原呈遞、瘤子的生長(zhǎng)與遷移、組織損傷的修復(fù)等。不同細(xì)胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能,可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物。外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu),能比較好的保護(hù)其包被的物質(zhì),且能靶向特定細(xì)胞或組織,因此是一種比較好靶向給藥系統(tǒng)。杭州胸水外泌體外泌體由各種類(lèi)型的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成,這些脂質(zhì)和蛋白質(zhì)衍生自形成外泌體的親代細(xì)胞。
外泌體與免疫反應(yīng)、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中樞的神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病和病癥進(jìn)展相關(guān)。由外泌體傳遞到受體細(xì)胞的蛋白質(zhì)、代謝物和核酸有效地改變了它們的生物反應(yīng)。這種外泌體介導(dǎo)的反應(yīng)可以促進(jìn)或阻止疾病。外泌體在調(diào)節(jié)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)通路方面的固有特性使其在許多疾病的診療控制方面具有潛在的用途,包括神經(jīng)退行性疾病和病癥。外泌體可被設(shè)計(jì)用于遞送不同的診療有效載荷,包括短干擾、反義寡核苷酸、化療藥物和免疫調(diào)節(jié)劑,并具有將其遞送到預(yù)期目標(biāo)的能力。
PEG沉淀法分離外泌體:通常通過(guò)將無(wú)水聚合物,如聚乙二醇(PEG),與樣品混合來(lái)沉淀外泌體。PEG聚合物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合水分子,增加疏水性蛋白和脂質(zhì)分子的相互結(jié)合力從而沉淀外泌體,然后通過(guò)離心分離外泌體。這種分離的方法快速,簡(jiǎn)便,可用于各種起始體積(從100μL到幾毫升)適合于各種研究和臨床設(shè)定。然而,這種方法缺乏選擇性,PEG聚合物不只會(huì)導(dǎo)致外泌體小泡沉淀,還會(huì)引起其他細(xì)胞外囊泡、細(xì)胞外蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體沉淀。因此,在使用這種方法之前,必須進(jìn)行樣品預(yù)處理,例如過(guò)濾或超速離心,以減少較終的外泌體制劑的污染。外泌體膜蛋白可以被蛋白酶剪切,剪切的碎片可以作為配體與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,從而活躍細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路。
常規(guī)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中,實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(RT-PCR)普遍用于microRNA的檢測(cè)實(shí)踐中,但外泌體樣品中的microRNA豐度極低,普通RT-PCR技術(shù)的靈敏度已經(jīng)不能夠滿(mǎn)足。第三代微滴式數(shù)字PCR——ddPCR技術(shù),成為外泌體microRNA檢測(cè)的選擇技術(shù)。微滴式數(shù)字PCR(DropletdigitalPCR),又成為“油包水PCR”,在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理,即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴,其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子,或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴(kuò)增后,逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè),有熒光信號(hào)的微滴判讀為1,沒(méi)有熒光信號(hào)的微滴判讀為0,根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。外泌體產(chǎn)生于細(xì)胞中的多泡體。組織外泌體提取試劑盒分類(lèi)
外泌體的提取的方式:PS親和法。腹水提取試劑盒方法
磁珠免疫法分離外泌體:將針對(duì)目的抗原的抗體通過(guò)生物素-鏈霉親和素連接到磁珠表面,然后將磁珠與樣品共孵育,使外泌體特異性結(jié)合到磁珠上形成磁珠-外泌體復(fù)合物,再用蒸餾水或者PBS沖洗,結(jié)尾用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脫獲得外泌體。該方法相對(duì)于ELISA的好處主要是,珠粒提供了更大的表面積來(lái)捕獲外泌體,從而提高了分離效率。此外,使用磁珠時(shí),樣品起始體積沒(méi)有上限,而基于微孔板的ELISA分析的較大樣品體積為100μL,且ELISA洗脫雜質(zhì)時(shí)容易造成孔間交叉污染。當(dāng)將磁珠法與金標(biāo)準(zhǔn)外泌體分離方法進(jìn)行比較時(shí),磁珠法可分離出更純凈的外泌體,特異性高、速度更快,并且不需要昂貴的儀器。另外,與其他分離方法(如超速離心或超濾)相比,磁珠法不影響外泌體形態(tài)。但是采用磁珠法時(shí),外泌體生物活性易受PH和鹽濃度影響。腹水提取試劑盒方法
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