免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔；18mm12孔；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min。免疫熒光技術(shù)可以用于研究內(nèi)臟移植和免疫抑制。LY6G免疫熒光IF

直接免疫熒光：單抗體（一抗）用于免疫染色和檢測目標(biāo)蛋白。熒光素結(jié)合的一抗直接與目標(biāo)抗原結(jié)合，并使用成像顯微鏡觀察。直接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：由于無需為兩種抗體選擇不同的物種反應(yīng)性，從而降低了物種交叉反應(yīng)性問題。與間接免疫熒光相比，時(shí)間縮短（操作步驟減少）。直接免疫熒光的缺點(diǎn)：不允許通過二抗進(jìn)行信號(hào)放大；檢測靈敏度降低；熒光素結(jié)合一抗的選擇有限；與使用熒光二抗的檢測相比，更昂貴。間接免疫熒光：使用兩種抗體（一抗和二抗）進(jìn)行免疫染色并檢測目標(biāo)蛋白。首先，用特異性一抗標(biāo)記目標(biāo)蛋白。然后，熒光素結(jié)合的二抗（與一抗具有不同的物種反應(yīng)性）識(shí)別結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物并與一抗結(jié)合。由于一個(gè)以上的二抗可以與一抗結(jié)合，熒光信號(hào)被放大，提供了更高的檢測靈敏度。BGLAP/OCN免疫熒光試驗(yàn)熒光抗體技術(shù)可以用于檢測和定位細(xì)胞或組織中的特定抗原物質(zhì)。

細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢？步驟：1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板），為后面照像打基礎(chǔ)。細(xì)胞密度適中，大約60-75%滿片即可，否則容易脫片。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘，現(xiàn)用現(xiàn)配。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗；4. 0.1%Triton作用20分鐘；5. PBS沖洗；6. 10%正常血清封閉10分鐘；7. 加入一抗，4度孵育過夜（找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來，抗體就不容易溢出），還要記住“砸片”，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻。抗體稀釋度1：60，較常用！8. PBS沖洗4次，各5分鐘；9加入熒光二抗，室溫30分鐘?？贵w稀釋度1：400，較常用！10. 90%甘油封片。也很關(guān)鍵阿，多封幾次才有體會(huì)。12. 避光保存，或到顯微鏡下觀察。

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時(shí)候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來。洗的時(shí)候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時(shí)，感覺前者效果好，PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(shí)(避光)，或者37度1半小時(shí)，PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核，然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒?huì)干，所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。免疫熒光技術(shù)可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1、建議細(xì)胞直接種孔板，采用倒置熒光顯微鏡拍照，這樣可以避免然后挑片時(shí)造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果；2、若實(shí)驗(yàn)室只有正置熒光顯微鏡，則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片。建議直接購買處理過的細(xì)胞爬片；若只有普通細(xì)胞爬片，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強(qiáng)，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜，若用酸浸泡過夜，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟。然后，用洗潔精搓洗爬片，然后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干，再將爬片置于超凈臺(tái)造紫外消毒后備用。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。collagen3免疫

免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。LY6G免疫熒光IF

細(xì)胞免疫熒光簡單實(shí)驗(yàn)步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時(shí)。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘。7. 一抗，4度過夜，一般要大于18小時(shí)或者37度，1-2小時(shí)。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時(shí)。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí)，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時(shí)間，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時(shí)。LY6G免疫熒光IF