熒光素標記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使然后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當以不起泡沫為宜）5～10min。②熒光素的準備：根據(jù)欲標記的蛋白質總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素，用分析天平準確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。③結合（或稱標記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內加完），加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h。結合期間應保持蛋白溶液于4℃左右，故須及時添冰去水；亦可將結合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中。免疫熒光技術具有高靈敏度和高特異性，可以檢測非常低濃度的目標分子。IL-10免疫熒光分析

檢測復雜的生物學結構需要較高清晰度的熒光信號，并將熒光信號從背景噪聲中分離開來。標準的免疫熒光標記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果。獲得良好圖片和較佳的可供發(fā)表的高質量圖像之間的差異就在于：需要精細調整樣品信號達到峰值特異性、高清晰度和較佳放大倍數(shù)。雖然熒光基團是進行高質量細胞成像的較佳選擇，但不可避免地也極易發(fā)生光漂白，即熒光信號的光化學降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差，產生假性結果?？勾銣绶馄瑒┛梢员Ｗo熒光標記蛋白的穩(wěn)定性，維持數(shù)周乃至數(shù)月的圖像信號完整度。Tyrosine Hydroxylase(TH)免疫熒光試驗熒光抗體技術具有高靈敏度和高特異性，可以實現(xiàn)精確的免疫檢測。

細胞和組織樣品處理：準備熒光標記的細胞樣品：為實現(xiàn)較佳的圖像質量，首先應建立針對目的蛋白和細胞結構的研究，同時將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細胞樣品用于標記–首先將細胞結構、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細胞內部，標記目的靶點。封閉細胞樣品，防止熒光標記物與研究無關的蛋白非特異性結合，較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結合。

免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進行標記而獲得成功。這種以熒光物質標記抗體而進行抗原定位的技術稱為熒光抗體技術。用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質結合，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術很少應用，所以人們習慣稱為熒光抗體技術，或稱為免疫熒光技術。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術顯示和檢查細胞或組織內抗原或半抗原物質等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）化學技術。免疫熒光技術是將抗體與熒光素等示蹤物質結合，通過抗原抗體反應進行定位。

免疫熒光實驗步驟：1.樣本準備：細胞或薄組織。對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。2.固定：取適當?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進入細胞與抗原結合。使用已知熒光抗原標記物質來檢查相應抗體的方法被稱為熒光抗原技術。IL-10免疫熒光分析

免疫熒光技術可以用于研究內臟移植和免疫抑制。IL-10免疫熒光分析

熒光效率：熒光分子不會將全部吸收的光能都轉變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度，除受激發(fā)光強度影響外，也與激發(fā)光的波長有關。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的較大吸收峰波長，且測定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時，得到的熒光強度也較大。IL-10免疫熒光分析