一、體外生物發(fā)光試驗(yàn)熒光素試劑的制備：D-熒光素，鉀鹽，無(wú)菌純水，完全培養(yǎng)基（自行配置）1、用無(wú)菌水制備100X熒光素原液（15mg/ml），輕輕顛倒搖動(dòng)至熒光素完全溶解?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b后-20℃凍存。2、將D-luciferin，potassiumsalt溶解于預(yù)熱好的組織培養(yǎng)基中制備成濃度為150μg/ml的工作液。用組織培養(yǎng)基1∶100稀釋儲(chǔ)存液，配置工作液(終濃度150μg/mL)3、去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基圖像分析前，向細(xì)胞培養(yǎng)板中添加1×熒光素工作液，然后進(jìn)行圖像分析-注射器濾膜過(guò)濾除菌，0.2μm注：成像前在37℃下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)間孵育可增強(qiáng)信號(hào)。異硫氰酸熒光素含有一個(gè)異硫氰酸酯反應(yīng)基團(tuán)這有助于其對(duì)通常存在于生物分子中的動(dòng)漫和巰基基團(tuán)具有反應(yīng)性。中國(guó)臺(tái)灣成都熒光染料

羅丹明屬于呫噸族。與市場(chǎng)上的許多其他染料相比，羅丹明具有出色的光穩(wěn)定性以及許多光物理特性，使其非常適合用作激光染料、熒光探針和顏料。它們?cè)诰酆衔锛{米粒子表面的表征、聚合物-生物偶聯(lián)物的檢測(cè)、活細(xì)胞的成像以及寡核苷酸在膠乳上的吸附分析等方面特別有用。羅丹明熒光染料的衍生物也用作：分子開(kāi)關(guān)，病毒表面修飾，化學(xué)傳感器，硫醇。不同類型的染料通過(guò)它們各自的取代基（R1、R2、R3、R4和G）來(lái)區(qū)分。由于它們的差異，這些熒光染料在溶液中也表現(xiàn)出不同的光物理特性（例如不同的熒光壽命和發(fā)射比較大值）。氨基被剛性化的羅丹明染料無(wú)論溫度范圍如何都表現(xiàn)出高量子產(chǎn)率，而在每個(gè)氮處具有兩個(gè)烷基取代基的那些表現(xiàn)出活化的內(nèi)部轉(zhuǎn)化，量子產(chǎn)率和熒光壽命隨溫度的變化而變化。羅丹明101和羅丹明B是一些**常用的羅丹明染料具有以下特點(diǎn)：--羧基傾向于在酸性溶液中質(zhì)子化--染料轉(zhuǎn)化為兩性離子堿性溶液--兩性離子染料在極性較小的有機(jī)溶劑中變?yōu)闊o(wú)色內(nèi)酯要將羅丹明用作熒光探針，必須對(duì)其進(jìn)行修改。這可以通過(guò)(thexanthenemoiety)氨基、羧基苯基環(huán)或羧酸基團(tuán)的修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)。與TRITC一樣，羅丹明(NHS-rhodamine)的熒光特性為544nm（比較大吸收波長(zhǎng)）和576nm（比較大發(fā)射）。化合物熒光染料紅色D-熒光素（D-Luciferin）是螢火熒光素酶底物，其量子效率為0.88，是Luminol的20倍。

一種發(fā)光雜環(huán)化合物，存在于生物發(fā)光的生物體中，如螢火蟲(chóng)。在含有三磷酸腺苷的情況下，通過(guò)熒光素酶氧化脫羧產(chǎn)生光。可用于熒光素酶生物發(fā)光成像和細(xì)胞高通量篩選應(yīng)用。D-熒光素（D-Luciferin）是螢火熒光素酶底物，其量子效率為0.88，是Luminol的20倍。反應(yīng)原理：首先，在鎂離子存在下熒光素酶使熒光素與ATP反應(yīng)，接著它被氧化形成二氧雜環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)并發(fā)出黃綠色的光。Luciferin-luciferase發(fā)光用于ATP監(jiān)控以測(cè)定細(xì)胞活力以及細(xì)菌計(jì)數(shù)。它還用于報(bào)告基因檢測(cè)?？膳c小動(dòng)物***成像系統(tǒng)配套使用，用于標(biāo)記LUC基因后的體內(nèi)***熒光檢測(cè)。D-熒光素游離酸（D-Luciferin,freeacid）、D-熒光素鉀鹽（D-Luciferin,potassiumsalt）和D-熒光素鈉鹽（D-Luciferin,sodiumsalt），鉀鹽、鈉鹽的形式是**通用的，因?yàn)樗鼈兌家兹苡谒?。鉀鹽也是***動(dòng)物檢測(cè)使用的主要形式。它們的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為328nm和533nm。

染料DiI, DiO, DiD 和 DiR是一類親脂性熒光染料家族，用于標(biāo)記細(xì)胞膜和疏水性組織。這是一類環(huán)境敏感型熒光染料，當(dāng)它們與膜結(jié)合或者與親脂性生物分子(例如蛋白質(zhì)，雖然在水中其熒光強(qiáng)度很弱)結(jié)合時(shí)，其熒光強(qiáng)度***增強(qiáng)。它們具有很高的淬滅系數(shù)，偏光依賴性和很短的激發(fā)壽命。一旦應(yīng)用于細(xì)胞中，這種染料會(huì)在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜中逐步擴(kuò)散，導(dǎo)致在其比較好濃度條件下，將整個(gè)細(xì)胞染色。它們不同的熒光顏色：DiI（橙色熒光）、DiO（綠色熒光）、DiD（紅色熒光）、DiR（深紅色熒光），為活細(xì)胞多色彩熒光成像分析和流式細(xì)胞術(shù)提供了一種便捷的工具。DiO和DiI可以分別與標(biāo)準(zhǔn)的FITC和TRITC濾光器一同使用。其中，DiO可以被633 nm He-Ne激光激發(fā)，并且具有比DiI更長(zhǎng)的激發(fā)和發(fā)射光波長(zhǎng)，為標(biāo)記細(xì)胞和組織的那些本身就具有本底熒光的染料提供了非常***的替代品。DiR在***成像或者示蹤中非常有用，因?yàn)樗鼈兯l(fā)射的紅外光可以高效地穿過(guò)細(xì)胞和組織，并且在紅外光范圍內(nèi)，其本底熒光水平很低。FITC熒光染料標(biāo)記方法。

CY5.5-NHS熒光染料是一種廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)記和成像的熒光染料，CY5.5-NHS熒光染料具有優(yōu)異的熒光性能。其激發(fā)波長(zhǎng)約為675nm，發(fā)射波長(zhǎng)約為695nm，位于紅色光譜區(qū)域，這使得它在生物樣本中具有較強(qiáng)的穿透力，能夠深入組織內(nèi)部進(jìn)行標(biāo)記和成像。此外，CY5.5-NHS熒光染料具有較高的熒光量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性，可以在較長(zhǎng)時(shí)間的激發(fā)下保持穩(wěn)定的熒光信號(hào)，從而確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。CY5.5-NHS熒光染料作為一種***的熒光染料，在生物科學(xué)研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。其優(yōu)異的熒光性能、良好的生物相容性、***的適用范圍以及易于合成和修飾的優(yōu)點(diǎn)，使得它成為生物醫(yī)學(xué)研究中不可或缺的重要工具。羰花青染料用作 Di 來(lái)標(biāo)記細(xì)胞、細(xì)胞器、脂質(zhì)體、病毒和脂蛋白。河南國(guó)產(chǎn)熒光染料

D-熒光素鉀鹽小動(dòng)物成像。中國(guó)臺(tái)灣成都熒光染料

注：建議對(duì)每只動(dòng)物模型都需要建立熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線，從而確定比較高信號(hào)檢測(cè)時(shí)間和信號(hào)平臺(tái)期。保存和操作的過(guò)程中都要避光。另外水溶性儲(chǔ)存液過(guò)濾除菌后，可以-20℃或-80℃分裝凍存，避免反復(fù)凍融。如果有條件，對(duì)儲(chǔ)存液充氮?dú)饣驓鍤猓ǚ乐寡趸€(wěn)定性和保存時(shí)間更長(zhǎng)。 注射方式，動(dòng)物類型以及體重等都會(huì)影響信號(hào)的發(fā)射，因此建議每次實(shí)驗(yàn)都要做熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線，確定比較好信號(hào)平臺(tái)期和比較好的檢測(cè)時(shí)間。熒光素鉀鹽和熒光素鈉鹽應(yīng)用上沒(méi)有差別，兩者的差別在于物理性狀上如外形和溶解性。鈉鹽的水溶性高于鉀鹽。從目前發(fā)表的文獻(xiàn)來(lái)看，鉀鹽的使用率遠(yuǎn)高于鈉鹽，尤其是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。兩者功效相同。 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。中國(guó)臺(tái)灣成都熒光染料

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