熒光染料標記蛋白或肽技術是一種常見的蛋白質體外標記技術。除了GFP等熒光蛋白的融合表達外，目標蛋白還可以通過熒光染料標記直接進行下游實驗操作，如***跟蹤、細胞分選等。

FITC熒光標記的原理是什么？

熒光標記所依賴的化合物稱為熒光材料。熒光材料是指具有共軛雙鍵系統(tǒng)化學結構的化合物。當受到紫外線或藍紫光的照射時，它可以被刺激為刺激狀態(tài)。當激發(fā)狀態(tài)恢復到基本狀態(tài)時，它會發(fā)出熒光。蛋白質熒光標記技術利用熒光材料的共價結合在目標分子的基團上，利用其熒光特性提供研究對象的信息。 Cy7 DiC18（DiR）是一個親脂性、近紅外熒光花青染料，這個染料常用于標記細胞質膜。海南小動物熒光染料

納米粒子納米顆粒是指尺寸在1到100納米之間的顆粒。由于它們的小尺寸，納米粒子通常用于不同類型的細胞和組織的熒光成像。當今生物成像中常用的一些納米材料包括碳點、貴金屬納米顆粒、聚合物點、量子點和熒光摻雜二氧化硅等。在成像中，與其他分子熒光團和探針相比，納米顆粒/納米材料具有多種優(yōu)勢，使其成為理想的選擇。除了提高亮度外，納米粒子是惰性的并且往往分布均勻，這有助于在成像過程中獲得更好的結果。此外，與各種分子熒光團相比，納米顆粒和納米材料沒有細胞毒性，并且不受非特異性結合問題的影響。由于這些特性，大多數(shù)熒光納米顆粒（染色納米顆粒）可以內化到細胞/組織中，并容易靶向給定部位。湖北廈門熒光染料花青類熒光染料屬于共振染料，其特征在于具有離域電荷的氮原子（兩個氮原子）之間的聚甲炔染料。

過標記——計算結果顯示每摩爾145,000MW的蛋白標記的熒光團大于10mol。雖然過標記的蛋白也可以使用，但可能會引起蛋白的聚集、降低抗體結合抗原的特異性，這些都會造成非特異性結合。過標記還會引起熒光淬滅?？梢栽黾拥鞍谆驕p少反應時間。3．未結合染料難以去除——盡管大部分時候用分離柱可以較好的純化蛋白偶聯(lián)物，但仍可能會有痕量的游離染料留在偶聯(lián)物溶液中，會使標記計算的值偏高。可用分離柱再次分離或透析去除。4．蛋白或蛋白偶聯(lián)物無法洗脫——不要再加緩沖液，只需再次離心一次或幾次。

熒光染料，由于靈敏度高，操作方便，逐漸取代了放射性同位素作為檢測標記，其廣泛應用于熒光免疫，熒光探針，細胞染色等。包括特異性的DNA染色，用于染色體分析、細胞周期、細胞凋亡等相關研究。另有很多核酸染料在多色染色系統(tǒng)中是非常有用的復染劑，可作為背景對照，標記細胞核使細胞內結構的空間關系一目了然。熒光標記的單克隆抗體技術為流式細胞儀在研究細胞膜和細胞內各種功能性抗原、**基因蛋白等領域擴展了無限的應用空間。熒光探針可以通過蛋白質交聯(lián)劑共價結合在單克隆抗體上。免疫熒光標記**常用的染料有異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、藻紅蛋白(PE)以及AlexaFluor系列染料等。核酸熒光染料對細胞核染色后定量測量細胞所發(fā)出的熒光強度，就可以確定細胞核中DNA、RNA的含量，并可以對細胞周期和細胞的增殖狀況進行分析。有多種熒光染料可以對細胞中的DNA或RNA染色，常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst33342等，RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。D-熒光素鉀鹽熒光染料。

細胞培養(yǎng)后，需要對其生長情況、形態(tài)甚至生物學性狀進行觀察。由于細胞小而復雜，若不借助適當?shù)氖侄?，難以觀察其形態(tài)、結構，更難發(fā)現(xiàn)細胞內各種組分的分子組成及功能。目前，已有多種研究細胞的技術，從光學顯微鏡到電子顯微鏡，從一般細胞化學法到免疫化學法。細胞染色是研究細胞生物學特征的一種常用手段，然而，對于細胞實驗新手來說，想要獲得一張漂亮的細胞染色圖并不容易。染色試劑不會選、細胞染色不均勻、染色時切片脫落等都是很常見的問題。

細胞膜常用染料DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常見的細胞膜染料（見表2），它們是一族親脂性的熒光染料，用于細胞的形態(tài)學和結構研究。該系列染料進入細胞膜后，會在整個細胞膜上側向擴散，在比較好濃度時可以使整個細胞膜染色。其中DiD染料的染色效率高，染色均一，熒光不易猝滅，無明顯細胞毒性，且受自身熒光背景干擾小。目前DiD已成功應用于多種細胞的體內示蹤研究，如Treg細胞、間充質干細胞、腫瘤細胞、造血干祖細胞等。 異硫氰酸熒光素含有一個異硫氰酸酯反應基團這有助于其對通常存在于生物分子中的動漫和巰基基團具有反應性。海南小動物熒光染料

DAPI染色液（DAPI Staining Solution）常用于細胞核染色，可將細胞核染成藍色。海南小動物熒光染料

所需的CY3-NHS酯的量取決于待標記蛋白的量，以及CY3-NHS的比較好摩爾比為10。示例：假設所需的標記蛋白為500μL2mg/mLIgG(MW=150,000)，用100μLDMSO溶解1mgCY3-NHS酯，得到所需的CY3-NHS酯體積為5.05μL，詳細計算過程如下：1)mmol(IgG)=mg/mL(IgG)×mL(IgG)/MW(IgG)=2mg/mL×0.5mL/150，000mg/mmol=6.7×10-6mmol2)mmol(CY3-NHS酯)=mmol(IgG)×10=6.7×10-6mmol×10=6.7×10-5mmol3)uL(CY3-NHS酯)=mmol(CY3-NHS酯)×MW(CY3-NHS酯)/mg/μL(CY3-NHS酯)=6.7×10-5mmol×753.88mg/mmol/0.01mg/μL=5.05μL(CY3-NHS酯)4.運行偶聯(lián)反應1)將室溫新鮮制備的10mg/mLCY3-NHS酯緩慢加入到0.5mL蛋白質樣品中于溶液中，輕輕搖動混勻，然后短暫離心，將樣品收集于反應管底部。請勿混勻，否則2)將反應管安置避光處，在接下來的間隔輕輕蛋白水解60分鐘。10-15分鐘，輕輕翻轉幾次以充分混合5.偶聯(lián)偶聯(lián)物以下方案是使用SepHadexG-25柱封閉染料-偶聯(lián)偶聯(lián)物的范例。1)根據(jù)制造說明準備SepHadexG-25柱。2)將反應混合物(來自“Runconjugationreaction”)加載到SepHadexG-25柱的頂部。3)一旦樣品在頂部樹脂表面下方運行，立即添加PBS(pH7.2-7.4)。4)向所需樣品添加更多PBS(pH7.2-7.4)即可完成柱密封。海南小動物熒光染料