第二種***使用的DNA染色方法是Hoechst染料，**初由化學(xué)公司HoechstAG生產(chǎn)。Hoechst33258、Hoechst33342和Hoechst34580都是鄰苯二甲酰亞胺，具有向A-T富集區(qū)插入的趨勢(shì)，因此后者不常使用。與DAPI相似，此類染料受到紫外線激發(fā)并在455nm下發(fā)射比較大值，在無(wú)結(jié)合狀態(tài)下變?yōu)?10–540nm。Hoechst染料還具有細(xì)胞滲透作用，因此可用于固定細(xì)胞和活細(xì)胞。與DAPI不同是，Hoechst染料毒性更低。DNA染色劑碘化丙啶無(wú)法透過(guò)細(xì)胞膜。在細(xì)胞培養(yǎng)中，因?yàn)樵撊旧珓o(wú)法進(jìn)入完好的細(xì)胞內(nèi)，所以常常被用來(lái)區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。碘化丙啶也是一種結(jié)合劑，但對(duì)不同的堿基沒(méi)有特異性。在核酸結(jié)合態(tài)下，其比較大激發(fā)波長(zhǎng)為538nm，比較高發(fā)射波長(zhǎng)為617nm。未結(jié)合狀態(tài)下碘化丙啶的比較大激發(fā)和發(fā)射被移到較短的波長(zhǎng)和較弱的強(qiáng)度。它也可以在不改變其熒光特性的情況下與RNA結(jié)合。要區(qū)分DNA和RNA，必須使用足夠的聚合酶。南京星葉生物提供多種性價(jià)比高的各類活化熒光素，例如Cy系列、Super Fluor 系列（效果同Alexa Fluor系列）等。廣西熒光染料Cy7.5

本質(zhì)上，有機(jī)染料的特征在于源自在整個(gè)生色團(tuán)上離域的光學(xué)躍遷或源自分子間電荷轉(zhuǎn)移躍遷（從激發(fā)電子態(tài)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移）的發(fā)射。在這里，表現(xiàn)出源自在整個(gè)生色團(tuán)上離域的光學(xué)躍遷的發(fā)射的染料被稱為共振染料（介觀染料），而后者被稱為CT染料（電荷轉(zhuǎn)移染料）?；ㄇ?、羅丹明和熒光素是一些最常見的共振染料，其特點(diǎn)是窄的吸收和發(fā)射帶（略微結(jié)構(gòu)化），往往相互鏡像，以及小的、對(duì)溶劑極性不敏感的斯托克斯位移。另一方面，CT染料包括香豆素和丹磺酰熒光團(tuán)等染料，其特點(diǎn)是與共振染料相比，吸收和發(fā)射帶結(jié)構(gòu)無(wú)結(jié)構(gòu)，分離良好，以及更大的斯托克斯位移。同樣，與共振染料相比，CT染料具有更小的摩爾吸收系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率。對(duì)于共振和CT熒光染料，在結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系眾所周知的情況下，可以通過(guò)精心設(shè)計(jì)的策略來(lái)微調(diào)光譜性質(zhì)。廣西熒光染料Cy7.5吲哚菁綠（Indocyanine Green，簡(jiǎn)稱ICG）是一種廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物領(lǐng)域的熒光染料。

3.粘壁細(xì)胞的染色（1）使粘壁的細(xì)胞在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。（2）從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過(guò)量培養(yǎng)液，將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。（3）在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動(dòng)使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。（4）在37℃培養(yǎng)細(xì)胞2～20分鐘，不同的細(xì)胞比較好培養(yǎng)時(shí)間不同。（5）吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2～3次，每次用預(yù)溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細(xì)胞，培養(yǎng)5～10分鐘，然后吸干培養(yǎng)基。

4.顯微鏡檢測(cè)（1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiS濾光器的選擇參見表1。（2）多色染料的同時(shí)檢測(cè)，濾光器按照以下設(shè)定：a)DiI和DiO＝OmegaXF52，Chroma51004；b)DiI和DiD＝OmegaXF92，Chroma51007；c)DiI，DiO和DiD＝OmegaXF93，Chroma61005

5.流式細(xì)胞儀的檢測(cè)DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染色的細(xì)胞可以分別用經(jīng)典的FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3和FL4流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

Cy7DiC18（DiR）是一個(gè)親脂性、近紅外熒光花青染料。這個(gè)染料常用于標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)膜。Cy7DiC18（DiR）的兩個(gè)18-碳鏈插入到細(xì)胞膜，從而進(jìn)行特定的、穩(wěn)定的細(xì)胞染色，幾乎不會(huì)發(fā)生細(xì)胞間的染料轉(zhuǎn)移。Cy7DiC18（DiR）（近紅外熒光）和其他細(xì)胞膜熒光染料如DiI（橙色熒光），DiO（綠色熒光），DiD（紅色熒光）配合使用，為多色成像和流式細(xì)胞分析提供了有效的工具。Cy7DiC18（DiR）染色后可進(jìn)行多聚甲醛（不可使用甲醇等其他試劑）的固定，但不建議在染色后進(jìn)行透化的過(guò)程。此外，在固定透化（室溫下用0.1%TritonX-100透化）后，也可以很好地進(jìn)行質(zhì)膜染色。

1、Cy7DiC18（DiR）染色固定的細(xì)胞或組織樣品時(shí)，通常使用配制在PBS中的4%多聚甲醛進(jìn)行固定，使用其它不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簳?huì)導(dǎo)致熒光背景較高。

2、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 染料DiI, DiO, DiD 和 DiR是一類親脂性熒光染料家族，用于標(biāo)記細(xì)胞膜和疏水性組織。

異硫氰酸熒光素(FITC)是一種有機(jī)熒光染料，目前，這種熒光染料仍用于免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中。在495/517nm處，該染料會(huì)產(chǎn)生激發(fā)/發(fā)射峰值，并可借助異硫氰酸鹽反應(yīng)基團(tuán)與不同抗體結(jié)合，該基團(tuán)可以和蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、咪唑、酪氨酰、羰基等基團(tuán)相結(jié)合。而它的基本成分——熒光素，其摩爾質(zhì)量為332g/mol，常被用作熒光示蹤劑。FITC(389g/mol)是用于熒光顯微鏡技術(shù)的首批染料，且其被當(dāng)成AlexaFluor®488等后續(xù)熒光染料的發(fā)端。該染料的熒光活性取決于它的大共軛芳香電子系統(tǒng)，而該系統(tǒng)受藍(lán)色光譜中的光所激發(fā)。經(jīng)常與FITC同時(shí)使用的另一種染料是與其相似的TRITC[四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸]。與FITC相反，TRITC并非熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。羅丹明也具有一個(gè)大的共軛芳香電子系統(tǒng)，正是該系統(tǒng)引發(fā)了它們的熒光行為。還有一點(diǎn)與FITC相反，TRITC(479g/mol)由比較**長(zhǎng)為550nm的綠色光譜中的光所激發(fā)，它的比較大發(fā)射波長(zhǎng)為573nm。與蛋白質(zhì)（例如，抗體）結(jié)合也基于異硫氰酸鹽反應(yīng)基團(tuán)。熒光染料可以單獨(dú)使用，也可以組合成復(fù)合熒光染料使用。廣西熒光染料Cy7.5

Super Flour 系列在生物熒光領(lǐng)域已逐漸替代FITC,Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7等熒光染料。廣西熒光染料Cy7.5

納米粒子納米顆粒是指尺寸在1到100納米之間的顆粒。由于它們的小尺寸，納米粒子通常用于不同類型的細(xì)胞和組織的熒光成像。當(dāng)今生物成像中常用的一些納米材料包括碳點(diǎn)、貴金屬納米顆粒、聚合物點(diǎn)、量子點(diǎn)和熒光摻雜二氧化硅等。在成像中，與其他分子熒光團(tuán)和探針相比，納米顆粒/納米材料具有多種優(yōu)勢(shì)，使其成為理想的選擇。除了提高亮度外，納米粒子是惰性的并且往往分布均勻，這有助于在成像過(guò)程中獲得更好的結(jié)果。此外，與各種分子熒光團(tuán)相比，納米顆粒和納米材料沒(méi)有細(xì)胞毒性，并且不受非特異性結(jié)合問(wèn)題的影響。由于這些特性，大多數(shù)熒光納米顆粒（染色納米顆粒）可以內(nèi)化到細(xì)胞/組織中，并容易靶向給定部位。廣西熒光染料Cy7.5