一、體外生物發(fā)光試驗(yàn)熒光素試劑的制備：D-熒光素，鉀鹽，無(wú)菌純水，完全培養(yǎng)基（自行配置）1、用無(wú)菌水制備100X熒光素原液（15mg/ml），輕輕顛倒搖動(dòng)至熒光素完全溶解?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b后-20℃凍存。2、將D-luciferin，potassiumsalt溶解于預(yù)熱好的組織培養(yǎng)基中制備成濃度為150μg/ml的工作液。用組織培養(yǎng)基1∶100稀釋儲(chǔ)存液，配置工作液(終濃度150μg/mL)3、去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基圖像分析前，向細(xì)胞培養(yǎng)板中添加1×熒光素工作液，然后進(jìn)行圖像分析-注射器濾膜過(guò)濾除菌，0.2μm注：成像前在37℃下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)間孵育可增強(qiáng)信號(hào)。南京星葉生物熒光染料標(biāo)記蛋白。福建濟(jì)南熒光染料

蛋白熒光標(biāo)記技術(shù)是目前**為常見(jiàn)的蛋白體外標(biāo)記技術(shù)，利用級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)原理，將極度敏感性且易于檢測(cè)的熒光素通過(guò)某個(gè)基團(tuán)吸附或共價(jià)結(jié)合后，標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)記物因增強(qiáng)放大效應(yīng)而產(chǎn)生顏色、光譜等變化，以分析示蹤相應(yīng)抗體或抗原性質(zhì)與含量的方法。該技術(shù)在具有高度精確性的熒光顯微鏡下，借助高度靈敏性的熒光檢測(cè)，在各種生物過(guò)程中對(duì)目的蛋白進(jìn)行可視化，從而通過(guò)抗原抗體高度特異性免疫定量表達(dá)或在細(xì)胞研究中定位。蛋白熒光標(biāo)記已成為研究蛋白質(zhì)互作、酶活性、***示蹤以及細(xì)胞分選重要工具。蛋白標(biāo)記常用熒光染料隨著蛋白熒光標(biāo)記技術(shù)不斷發(fā)展，各類(lèi)熒光素廣泛應(yīng)用于生物實(shí)驗(yàn)中，目前常用標(biāo)記蛋白/抗體的熒光素主要有BODIPY類(lèi)、香豆素類(lèi)、羅丹明類(lèi)、近紅外類(lèi)、NBD胺類(lèi)以及菁染料等。南京星葉生物科技有限公司提供多種性?xún)r(jià)比高的各類(lèi)活化熒光素，其熒光染料覆蓋波長(zhǎng)范圍從350nm到790nm，例如Cy系列、SuperFluor系列（效果同AlexaFluor系列）等，用于標(biāo)記抗體、多肽以及蛋白功能基團(tuán)，繼而生成分子探針，通過(guò)熒光成像進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。貴州熒光染料Fluor 555羅丹明具有出色的光穩(wěn)定性以及許多光物理特性，使其非常適合用作激光染料、熒光探針和顏料。

CY7是一種CY染料。CY為花菁(Cyanine)的縮寫(xiě)，是由奇數(shù)個(gè)甲基單元連接的兩個(gè)氮原子組成的化合物。菁類(lèi)化合物具有波長(zhǎng)長(zhǎng)、吸收和發(fā)射可調(diào)、消光系數(shù)高的特點(diǎn)CY系染料常被用于蛋白、抗體以及小分子化合物的標(biāo)記，對(duì)于蛋白抗體的標(biāo)記，可以通過(guò)簡(jiǎn)單的混合反應(yīng)來(lái)完成結(jié)合，下面我們介紹了蛋白抗體標(biāo)記的標(biāo)記方法，具有一定的參考意義。一、比較好蛋白制備1)為獲得標(biāo)記效果，請(qǐng)制備蛋白(抗體)濃度為2mg/mL。2)蛋白溶液的pH值為8.5±0.5。如果pH值低于8.0，應(yīng)使用1M3)如果蛋白濃度低于2mg/mL，標(biāo)記效率會(huì)**降低。為獲得比較好標(biāo)記效率，建議**終蛋白濃度范圍為2-10mg/mL。4)蛋白必須在不含伯胺(如Tris或甘氨酸)的緩沖液中，和銨離子，否則會(huì)影響標(biāo)記效率。2.染色制備(以CY3-NHS酯為例)將無(wú)水DMSO加入CY3-NHS酯小瓶中，制備成10mM儲(chǔ)備液。通過(guò)移液器或渦旋混合均勻計(jì)算。使用前需先使用縮合液(500μg/mL)(HY-D0178)活化另一個(gè)可進(jìn)行后續(xù)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。

琥珀酰亞胺酯（Succinimidylesters）/NHS酯活性熒光染料用于標(biāo)記抗體，蛋白質(zhì)，肽，胺修飾的寡核苷酸和其他生物分子上的游離氨基（-NH2）2、馬來(lái)酰亞胺（Maleimides）活性熒光染料用于標(biāo)記抗體，蛋白質(zhì)和肽上的巰基3、疊氮化物(Azides)活性熒光染料通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)法（Click）標(biāo)記乙烯基4、炔烴(Alkynes)活性熒光染料通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)方法標(biāo)記疊氮化物5、羧酸(Carboxylicacids)活性熒光染料經(jīng)碳二亞胺預(yù)活化后用于標(biāo)記胺或用于醇的Steglich酯化6、氨基(Amines)活性熒光染料具有游離氨基的熒光染料，用于與各種親電子化合物（如活化的酯和環(huán)氧化物）偶聯(lián)。小動(dòng)物成像熒光染料能夠選擇性地與目標(biāo)細(xì)胞或組織結(jié)合。

常用抗體標(biāo)記熒光染料的特性及其應(yīng)用

1、FITC:激發(fā)波長(zhǎng)488nm，比較大發(fā)射波長(zhǎng)525nm。1)其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氟離子激光器的流式細(xì)胞儀;2)在流式細(xì)胞儀的FL1通道檢測(cè);3)可用于熒光顯微鏡技術(shù)4)熒光強(qiáng)度易受PH值影響，PH值降低時(shí)其熒光強(qiáng)度減弱。2、AlexaFluor488:激發(fā)波長(zhǎng)488nm，比較大發(fā)射波長(zhǎng)519nm。1)其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氟離子激光器的流式細(xì)胞儀:2)在流式細(xì)胞儀的FL1通道檢測(cè);3)具有超乎尋常的光穩(wěn)定性，非常適用于熒光顯微鏡技術(shù);4)在較寬的PH值范圍內(nèi)保持穩(wěn)定(PH4~10)。5)南京星葉生物科技有限公司SuperFluor系列（效果同AlexaFluor系列）質(zhì)優(yōu)價(jià)廉，歡迎咨詢(xún)。3、Cy3:激發(fā)波長(zhǎng)488nm，比較大發(fā)射波長(zhǎng)570nm。1)其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氟離子激光器的流式細(xì)胞儀;2)在流式細(xì)胞儀的FL2通道檢測(cè):3)適用于熒光顯微鏡技術(shù);4)為小分子染料，非常適合需小分子染料的流式細(xì)胞術(shù)，熒光強(qiáng)度低于PE。 Cy3染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰分別在550 nm和570 nm左右。水溶熒光染料標(biāo)記

Super Fluor活化酯（與Invitrogen的Alexa Fluor活化酯完全相同）。福建濟(jì)南熒光染料

異硫氰酸熒光素(FITC)是一種有機(jī)熒光染料，目前，這種熒光染料仍用于免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中。在495/517nm處，該染料會(huì)產(chǎn)生激發(fā)/發(fā)射峰值，并可借助異硫氰酸鹽反應(yīng)基團(tuán)與不同抗體結(jié)合，該基團(tuán)可以和蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、咪唑、酪氨酰、羰基等基團(tuán)相結(jié)合。而它的基本成分——熒光素，其摩爾質(zhì)量為332g/mol，常被用作熒光示蹤劑。FITC(389g/mol)是用于熒光顯微鏡技術(shù)的首批染料，且其被當(dāng)成AlexaFluor®488等后續(xù)熒光染料的發(fā)端。該染料的熒光活性取決于它的大共軛芳香電子系統(tǒng)，而該系統(tǒng)受藍(lán)色光譜中的光所激發(fā)。經(jīng)常與FITC同時(shí)使用的另一種染料是與其相似的TRITC[四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸]。與FITC相反，TRITC并非熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。羅丹明也具有一個(gè)大的共軛芳香電子系統(tǒng)，正是該系統(tǒng)引發(fā)了它們的熒光行為。還有一點(diǎn)與FITC相反，TRITC(479g/mol)由比較**長(zhǎng)為550nm的綠色光譜中的光所激發(fā)，它的比較大發(fā)射波長(zhǎng)為573nm。與蛋白質(zhì)（例如，抗體）結(jié)合也基于異硫氰酸鹽反應(yīng)基團(tuán)。福建濟(jì)南熒光染料