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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：出現(xiàn)非特異性擴增帶：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。為了很大限度地減少污染的可能性，調(diào)...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：Taq(水生棲熱菌)聚合酶耐熱DNA聚合酶的很好活性溫度約為75-80°C(167-176°F),盡管該酶通常使用72°C(162°F)的溫度。在該步驟中，DNA聚合酶通過從反應(yīng)混合物中添加在5’-至-3’方向上與模板互補的游離DNA鏈來合成與DNA模板鏈互補的新DNA鏈，在新生(伸長)DNA鏈的末端，將dNTPs的5'-磷酸基與3'-羥基縮合。延伸所需的精確時間取決于所使用的DNA聚合酶和要擴增的DNA目標(biāo)區(qū)域的長度。根據(jù)經(jīng)驗，在很好溫度下，大多數(shù)DNA聚合酶每分鐘聚合一千個堿基。在很好條件下(即，如果沒有限制底物或試劑的限制)，在每個延伸/延伸步驟中，DNA靶序列的數(shù)量加倍...

聚合酶鏈反應(yīng)允許快速生產(chǎn)短DN段，即使已知的引物序列不超過兩個。聚合酶鏈反應(yīng)的這種能力增強了許多方法，例如生成雜交 探針用于 Southern 或northern blot 雜交。聚合酶鏈反應(yīng)為這些技術(shù)提供了大量的純DNA，有時是單鏈的，甚至可以從非常少量的起始材料中進行分析。脫氧核糖核酸測序的任務(wù)也可以通過聚合酶鏈反應(yīng)來輔助完成。已知的DN段可以很容易地從患有遺傳疾病突變的患者體內(nèi)產(chǎn)生。對擴增技術(shù)的修飾可以從完全未知的基因組中提取片段，或者可以產(chǎn)生感興趣區(qū)域的單鏈。聚合酶鏈反應(yīng)有許多應(yīng)用于傳統(tǒng)的 DNA克隆。它可以從更大的基因組中提取片段以插入載體，這可能只有少量可用。使用一組“載體引物”，...

聚合酶鏈反應(yīng)有許多優(yōu)點。它很容易理解和使用，并迅速產(chǎn)生結(jié)果。這項技術(shù)非常敏感，有可能產(chǎn)生數(shù)百萬到數(shù)十億份特定產(chǎn)品的拷貝，用于測序、克隆和分析。qRT-PCR具有與PCR相同的優(yōu)點，同時還具有定量合成產(chǎn)物的優(yōu)點。因此，它可以用于分析病癥、微生物或其他疾病狀態(tài)中基因表達水平的變化。聚合酶鏈反應(yīng)是一種非常強大和實用的研究工具。許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應(yīng)得到解決。這項技術(shù)可以幫助我們識別與已知病毒相關(guān)的未知病毒序列，從而讓我們更好地了解疾病本身。如果該過程可以進一步簡化，并且可以開發(fā)靈敏的非輻射檢測系統(tǒng)，PCR將在未來幾年在臨床實驗室中占據(jù)明顯地位。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：RNA和DNA的五碳糖，前者比后者多了一個O，由于多出來的O原子造成了RNA和DNA的堿基不同，即O原子造成U和T的不同，U分子化學(xué)式C4H4N2O2，T胸腺嘧啶化學(xué)式C5H6N2O2，現(xiàn)在將兩個分子式進行對比，U比T多了CH2，結(jié)合前面的核糖區(qū)別，還有一個O分子，其余結(jié)構(gòu)相同，那么O和CH2之間的聯(lián)系是什么?是什么導(dǎo)致DNA和RNA的區(qū)別是RNA比DNA多了O和CH2？或者說如何將病毒的堿基中U變成DNA堿基中的T？若從結(jié)構(gòu)上說，直接從U中加入一個CH2，得到了T，這里面介入化學(xué)鍵的斷裂和重組，但是這樣一來的話，即使U變成了T，但是核糖依舊是RNA比DNA多了一個O分子，只是...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的步驟：標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性很好）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行。熱啟動聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：一種在PCR的...

聚合酶鏈反應(yīng)允許快速生產(chǎn)短DN段，即使已知的引物序列不超過兩個。聚合酶鏈反應(yīng)的這種能力增強了許多方法，例如生成雜交 探針用于 Southern 或northern blot 雜交。聚合酶鏈反應(yīng)為這些技術(shù)提供了大量的純DNA，有時是單鏈的，甚至可以從非常少量的起始材料中進行分析。脫氧核糖核酸測序的任務(wù)也可以通過聚合酶鏈反應(yīng)來輔助完成。已知的DN段可以很容易地從患有遺傳疾病突變的患者體內(nèi)產(chǎn)生。對擴增技術(shù)的修飾可以從完全未知的基因組中提取片段，或者可以產(chǎn)生感興趣區(qū)域的單鏈。聚合酶鏈反應(yīng)有許多應(yīng)用于傳統(tǒng)的 DNA克隆。它可以從更大的基因組中提取片段以插入載體，這可能只有少量可用。使用一組“載體引物”，...

聚合酶鏈反應(yīng)的一個主要限制是，為了產(chǎn)生允許其選擇性擴增的引物，需要關(guān)于目標(biāo)序列的先前信息。這意味著，通常情況下，PCR用戶必須知道兩個單鏈模板中每個模板上目標(biāo)區(qū)域上游的精確序列，以確保DNA聚合酶正確結(jié)合引物-模板雜交體，并隨后在DNA合成過程中產(chǎn)生整個目標(biāo)區(qū)域。像所有酶一樣，DNA聚合酶也容易出錯，這反過來會導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變。PCR的另一個限制是，即使是很少量的污染DNA也可以被擴增，導(dǎo)致誤導(dǎo)或模糊的結(jié)果。為了很大限度地減少污染的可能性，調(diào)查人員應(yīng)該為試劑制備、聚合酶鏈反應(yīng)和產(chǎn)品分析預(yù)留單獨的房間。試劑應(yīng)分配到一次性的等分試樣中。應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。...

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：無擴增條帶：酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當(dāng)而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。變性溫度是否準(zhǔn)確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活；過低則模板變性不徹底。反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10 min。引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存條件不當(dāng)而失活。引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。 DNA凝...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對PCR擴增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列。兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴增。引物3‘端的堿基，特別是很末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。在嵌套聚合酶鏈反應(yīng)中，除了預(yù)期的靶之外，該產(chǎn)物可能仍然由非特異性擴增的DN段組成。蘇州細胞Real-time PCR技術(shù)服務(wù)聚合酶鏈?zhǔn)剑篜CR由變性--...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗污染：實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測：一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。重復(fù)性試驗。選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增。PCR的另一個限制是，即使是很少量的污染DNA也可以被擴增，導(dǎo)致誤導(dǎo)或模糊的結(jié)果。徐州特殊樣本RT-PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站聚合酶鏈反應(yīng)：在檢測病原體方面,病...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：10×擴增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）、引物（終濃度）、模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+（終濃度）、補加雙蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實驗調(diào)整，以上表格只提供大致參考值。PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段，細胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。引物有多種設(shè)計方法，由PCR在實驗中的目的決定，但基本原則相同。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。南京特殊樣本PCR檢測技術(shù)服務(wù)聚合...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：陰性：需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不但要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點：靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（μg=-6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位）；在細菌學(xué)中很小檢出率為3個細菌。簡便、快速：PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)...

聚合酶鏈反應(yīng)有許多優(yōu)點。它很容易理解和使用，并迅速產(chǎn)生結(jié)果。這項技術(shù)非常敏感，有可能產(chǎn)生數(shù)百萬到數(shù)十億份特定產(chǎn)品的拷貝，用于測序、克隆和分析。qRT-PCR具有與PCR相同的優(yōu)點，同時還具有定量合成產(chǎn)物的優(yōu)點。因此，它可以用于分析病癥、微生物或其他疾病狀態(tài)中基因表達水平的變化。聚合酶鏈反應(yīng)是一種非常強大和實用的研究工具。許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應(yīng)得到解決。這項技術(shù)可以幫助我們識別與已知病毒相關(guān)的未知病毒序列，從而讓我們更好地了解疾病本身。如果該過程可以進一步簡化，并且可以開發(fā)靈敏的非輻射檢測系統(tǒng)，PCR將在未來幾年在臨床實驗室中占據(jù)明顯地位。嵌套聚合酶鏈反應(yīng)的兩組引物用于兩個...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：10×擴增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）、引物（終濃度）、模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+（終濃度）、補加雙蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實驗調(diào)整，以上表格只提供大致參考值。PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段，細胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。引物有多種設(shè)計方法，由PCR在實驗中的目的決定，但基本原則相同。嵌套式PCR在特異性擴增長DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功，但它需要更詳細的目標(biāo)序列知識。徐州血...

PCR的反應(yīng)條件：dNTP濃度過高會加快反應(yīng)速度，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，低則合成產(chǎn)物量減少。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸，一個30個循環(huán)的擴增反應(yīng)0.1%-0.25%總錯誤率。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結(jié)合。引物長度在15～25時退火溫度。如果基因的基因組DNA序列是已知的，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可以用來繪制基因...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，在生物體外復(fù)制特定DN段的核酸合成技術(shù)。透過這項技術(shù)，可在短時間內(nèi)大量擴增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應(yīng)是是一種簡單，廉價和可靠的方法復(fù)制DN段，這個概念適用于現(xiàn)物學(xué)和相關(guān)科學(xué)的許多領(lǐng)域。 PCR可能是分子生物學(xué)中使用很較廣的技術(shù)。這種技術(shù)被用于生物醫(yī)學(xué)研究，犯罪取證和分子考古學(xué)。通常，PCR由一系列20-40次重復(fù)的溫度變化組成，稱為熱循環(huán)，每個循環(huán)通常由兩個或三個離散的溫度步驟組成。PCR的另一個限制是，即使是很少量的污染DNA也可以被擴增，導(dǎo)致誤導(dǎo)或模糊的結(jié)果。南京分子生物學(xué)數(shù)字PCR網(wǎng)站聚合酶...

PCR的反應(yīng)條件：Tm=4（G+c）+（A+T），一般在45～55度，溫度低容易退火但特異性低；溫度高，不容易退火但特異性高。退火時間30秒。延伸溫度一般在70～75度這時TaqDNA聚合酶活性很高（150個/S），當(dāng)引物在16個堿基以下時可采用緩慢升高溫度到70～75度的方法，使在低溫下就開始合成。一般

現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。檢測：PCR反應(yīng)擴增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是很常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。電子聚合酶鏈反應(yīng)用于計算理論聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果。連云港細胞熒光PCR原理及步驟聚合酶鏈反應(yīng)：多重連接依賴探針擴增（MLPA):允許用單個引物...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：RNA和DNA的五碳糖，前者比后者多了一個O，由于多出來的O原子造成了RNA和DNA的堿基不同，即O原子造成U和T的不同，U分子化學(xué)式C4H4N2O2，T胸腺嘧啶化學(xué)式C5H6N2O2，現(xiàn)在將兩個分子式進行對比，U比T多了CH2，結(jié)合前面的核糖區(qū)別，還有一個O分子，其余結(jié)構(gòu)相同，那么O和CH2之間的聯(lián)系是什么?是什么導(dǎo)致DNA和RNA的區(qū)別是RNA比DNA多了O和CH2？或者說如何將病毒的堿基中U變成DNA堿基中的T？若從結(jié)構(gòu)上說，直接從U中加入一個CH2，得到了T，這里面介入化學(xué)鍵的斷裂和重組，但是這樣一來的話，即使U變成了T，但是核糖依舊是RNA比DNA多了一個O分子，只是...

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。完整RNA 的提取和純化，是進行RNA 方面的研究工作，如Nothern雜交、mRNA 分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個關(guān)鍵點，即樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使白復(fù)合體變性；對內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制；有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中很關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性。...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：Taq(水生棲熱菌)聚合酶耐熱DNA聚合酶的很好活性溫度約為75-80°C(167-176°F),盡管該酶通常使用72°C(162°F)的溫度。在該步驟中，DNA聚合酶通過從反應(yīng)混合物中添加在5’-至-3’方向上與模板互補的游離DNA鏈來合成與DNA模板鏈互補的新DNA鏈，在新生(伸長)DNA鏈的末端，將dNTPs的5'-磷酸基與3'-羥基縮合。延伸所需的精確時間取決于所使用的DNA聚合酶和要擴增的DNA目標(biāo)區(qū)域的長度。根據(jù)經(jīng)驗，在很好溫度下，大多數(shù)DNA聚合酶每分鐘聚合一千個堿基。在很好條件下(即，如果沒有限制底物或試劑的限制)，在每個延伸/延伸步驟中，DNA靶序列的數(shù)量加倍...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：陰性：需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不但要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的步驟：標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性很好）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的基本原理類...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：因為PCR擴增了目的DNA區(qū)域，所以PCR可以用于分析極少量的樣品。這對于法醫(yī)檢定法，當(dāng)時只有微量的DNA可作為證據(jù)。聚合酶鏈反應(yīng)也可用于分析古代DNA那已經(jīng)有數(shù)萬年的歷史了。這些基于聚合酶鏈反應(yīng)的技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于動物身上，例如四萬年前猛犸，以及人類DNA，應(yīng)用范圍從分析埃及木乃伊識別一個俄羅斯沙皇和英國國王理查三世遺體的鑒定。定量聚合酶鏈反應(yīng)或者實時聚合酶鏈反應(yīng)不要與逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法混淆)允許估計樣品中存在的給定序列的量——這種技術(shù)通常用于定量確定基因表達的水平。定量PCR是一種已建立的DNA定量工具，用于測量每輪PCR擴增后DNA產(chǎn)物的積累。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。像所有酶一樣，DNA聚合酶也容易出錯，這反過來會導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。工具/原料：擴增緩沖液，四種dNTP，引物，模板DNA，Taq DNA聚合酶， Mg離子，蒸餾水。模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的...