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來源： 發(fā)布時間：2024-06-09

免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation, IP）是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)復(fù)合物組成以及特定蛋白質(zhì)的表達和純化的實驗技術(shù)。
基本原理
免疫沉淀技術(shù)基于抗體與特定蛋白質(zhì)（抗原）之間的特異性相互作用。通過使用針對目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性抗體，可以從含有多種蛋白質(zhì)的復(fù)雜樣本中捕獲并富集目標(biāo)蛋白質(zhì)。
免疫沉淀技術(shù)有多種類型，包括：
1. 個別免疫沉淀法（Individual IP）
2. 免疫共沉淀法（Co-IP）
3. 染色質(zhì)免疫沉淀法（ChIP）
4. RNA免疫沉淀法（RIP）
近年來，免疫沉淀技術(shù)在固相支持物的選擇上有了很大進步。磁性微珠因其操作簡便、快速和自動化程度高而逐漸取代了傳統(tǒng)的瓊脂糖樹脂。
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Co-IP的實驗步驟：
1. 細胞裂解：首先，細胞或組織被裂解，釋放其中的蛋白質(zhì)。
2. 抗體結(jié)合：然后，將特異性抗體（針對已知蛋白質(zhì)之一的抗體）加入到裂解物中。這些抗體會特異性地結(jié)合到目標(biāo)蛋白（誘餌蛋白）上。
3. 免疫復(fù)合物形成：抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合后，形成免疫復(fù)合物。
4. 沉淀：接著，使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子（如瓊脂糖或磁性珠子）來捕獲免疫復(fù)合物。蛋白A或蛋白G能夠與抗體的Fc部分結(jié)合，從而拉下抗體以及與之結(jié)合的目標(biāo)蛋白和任何相關(guān)的相互作用蛋白。
5. 洗滌：捕獲的免疫復(fù)合物被洗滌以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
6. 洗脫和分析：免疫復(fù)合物被洗脫并進行進一步的分析，如Western blot（WB）或質(zhì)譜分析，以鑒定相互作用的蛋白質(zhì)。
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免疫沉淀技術(shù)的實驗方法通常包括以下步驟：
1. 樣本準(zhǔn)備
2. 細胞裂解：使用裂解緩沖液（含有蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解）裂解細胞，釋放蛋白質(zhì)。
3. 蛋白質(zhì)濃度測定：使用BCA、Bradford或Lowry等方法測定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度。
4. 抗體預(yù)處理：如果使用預(yù)固定的抗體，需先將抗體固定在固相支持物上，如瓊脂糖珠或磁性微珠。
5. 免疫沉淀反應(yīng)：將裂解液與特異性抗體（固定或未固定）混合，并在4°C下緩慢搖晃孵育過夜，以允許抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)充分結(jié)合。
6. 固相支持物的回收：對于未固定的抗體，加入與抗體特異性結(jié)合的蛋白A或蛋白G結(jié)合的固相支持物。
7. 洗滌：去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)，通常需要多次洗滌固相支持物。
8. 洗脫：使用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液（如加熱的SDS加載緩沖液或酸性緩沖液）從固相支持物上洗脫免疫復(fù)合物。
9. 后續(xù)分析：對洗脫的蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE電泳、Western Blot、質(zhì)譜分析等，以進一步分析目標(biāo)蛋白質(zhì)。
10. 對照實驗：包括正對照（已知能沉淀目標(biāo)蛋白的抗體）和負對照（非特異性抗體或無抗體）以驗證實驗的特異性。

免疫沉淀（IP）實驗中抗體的選擇非常關(guān)鍵，因為抗體的特異性和親和力直接影響到實驗的成功與否。
1. 特異性：抗體應(yīng)當(dāng)對目標(biāo)蛋白具有高度的特異性，以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
2. 親和力：抗體對目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高，以確保在免疫沉淀過程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白。
3. 抗體類型：單克隆抗體和多克隆抗體都可以用于IP實驗。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性，而多克隆抗體可能提供更強的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗證：選擇已經(jīng)過免疫沉淀（IP）或相關(guān)應(yīng)用（如Western blot, IHC）驗證的抗體，這增加了實驗成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息：選擇信譽良好的抗體供應(yīng)商，并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評價，以幫助做出決策。
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Co-IP（免疫共沉淀）技術(shù)主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，其應(yīng)用場景如下：
1. 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的鑒定：Co-IP可用于構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的結(jié)合伙伴。
2. 信號傳導(dǎo)途徑的研究：通過Co-IP技術(shù)，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了許多關(guān)鍵的細胞信號通路，如MAPK和PI3K/Akt通路等，為深入理解這些通路的功能和調(diào)控機制提供了重要線索。
3. 藥物靶點篩選：利用Co-IP技術(shù)，研究人員可以篩選潛在的藥物靶點。
疾病機制研究：通過分析疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用，Co-IP有助于揭示疾病的分子機制。
4. 抗體藥物開發(fā)：Co-IP可用于研究抗體藥物與其靶標(biāo)蛋白的結(jié)合特性，評估抗體藥物的親和力和特異性。
5. 轉(zhuǎn)錄因子研究：Co-IP技術(shù)可以用于研究轉(zhuǎn)錄因子與蛋白質(zhì)的相互作用，進而揭示基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
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免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用。蘇州RIP免疫沉淀磁珠現(xiàn)貨

免疫沉淀實驗步驟：
1. 樣品制備
a. 懸浮細胞樣品處理：離心收集細胞（4℃, 1000g, 5 min），用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail，使蛋白酶抑制劑Cocktail的終濃度為1×）?；靹蚝笾糜诒咸幚?0 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。
b. 貼壁細胞樣品處理：移去培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞兩遍；用細胞刮棒刮脫細胞，收集至1.5mL EP管內(nèi)，按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail，使蛋白酶抑制劑Cocktail的終濃度為1×）。吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸?；靹蚝笾糜诒咸幚?0 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。
4. 后續(xù)：磁珠預(yù)處理——抗體吸附——抗原結(jié)合反應(yīng)——抗體洗脫
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標(biāo)簽： 支原體 免疫沉淀