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蘇州IP免疫沉淀實(shí)驗(yàn)視頻

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2024-07-01

免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)中抗體的選擇非常關(guān)鍵,因?yàn)榭贵w的特異性和親和力直接影響到實(shí)驗(yàn)的成功與否。
1. 特異性:抗體應(yīng)當(dāng)對(duì)目標(biāo)蛋白具有高度的特異性,以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合,導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
2. 親和力:抗體對(duì)目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高,以確保在免疫沉淀過(guò)程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白。
3. 抗體類(lèi)型:?jiǎn)慰寺】贵w和多克隆抗體都可以用于IP實(shí)驗(yàn)。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性,而多克隆抗體可能提供更強(qiáng)的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗(yàn)證:選擇已經(jīng)過(guò)免疫沉淀(ChIP)或相關(guān)應(yīng)用(如Western blot, IHC)驗(yàn)證的抗體,這增加了實(shí)驗(yàn)成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息:選擇信譽(yù)良好的抗體供應(yīng)商,并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶(hù)評(píng)價(jià),以幫助做出決策。
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免疫沉淀IP實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶(hù)實(shí)驗(yàn)情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu)  (直徑 50-150 μm)  可以結(jié)合抗體  (繼而結(jié)合靶蛋白) ,它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體,而不需借助特殊的專(zhuān)業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu),這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸,具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同,磁珠是固體,抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ,盡管磁珠沒(méi)有多孔中心增加結(jié)合能力,但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多,使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿(mǎn)足高容量的抗體結(jié)合。
簡(jiǎn)而言之,瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng),而磁珠在得率,可重復(fù)性以及自動(dòng)化方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。
上海蛋白免疫沉淀磁珠應(yīng)用免疫沉淀純化所得抗原純度低是什么原因?

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RIP(RNA Immunoprecipitation,RNA免疫沉淀)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要考慮多個(gè)方面,以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。
1. 目標(biāo)蛋白的選擇:確定你想要研究的目標(biāo)RNA結(jié)合蛋白(RBP)。
2. 陽(yáng)性和陰性對(duì)照:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí),需要包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)與裂解:選擇合適的細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行培養(yǎng)。
4. 抗體孵育:將特異性抗體與細(xì)胞裂解液孵育,以形成抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。
5. 免疫沉淀:使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子進(jìn)行免疫沉淀,捕獲抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。
6. 洗滌和分離:洗滌珠子以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA。從珠子上分離RNA,可能需要使用低pH緩沖液或蛋白酶K處理。
7. RNA分析:使用qPCR、Northern blot或RNA-Seq等方法分析沉淀下來(lái)的RNA。
8. 數(shù)據(jù)分析:對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量分析,比較不同樣品之間的RNA水平。

9. 實(shí)驗(yàn)重復(fù):為了確保結(jié)果的可靠性,實(shí)驗(yàn)應(yīng)該進(jìn)行至少三次重復(fù)。

10. 技術(shù)驗(yàn)證:使用其他技術(shù)(如RNA-pull down或FISH)驗(yàn)證RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Co-IP的實(shí)驗(yàn)步驟:
1. 細(xì)胞裂解:首先,細(xì)胞或組織被裂解,釋放其中的蛋白質(zhì)。
2. 抗體結(jié)合:然后,將特異性抗體(針對(duì)已知蛋白質(zhì)之一的抗體)加入到裂解物中。這些抗體會(huì)特異性地結(jié)合到目標(biāo)蛋白(誘餌蛋白)上。
3. 免疫復(fù)合物形成:抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合后,形成免疫復(fù)合物。
4. 沉淀:接著,使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子(如瓊脂糖或磁性珠子)來(lái)捕獲免疫復(fù)合物。蛋白A或蛋白G能夠與抗體的Fc部分結(jié)合,從而拉下抗體以及與之結(jié)合的目標(biāo)蛋白和任何相關(guān)的相互作用蛋白。
5. 洗滌:捕獲的免疫復(fù)合物被洗滌以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
6. 洗脫和分析:免疫復(fù)合物被洗脫并進(jìn)行進(jìn)一步的分析,如Western blot(WB)或質(zhì)譜分析,以鑒定相互作用的蛋白質(zhì)。
免疫沉淀技術(shù)RIP的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

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免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation,簡(jiǎn)稱(chēng)IP)是一種生物化學(xué)方法,它利用特異性抗體對(duì)抗原進(jìn)行親和純化。在含有目的抗原的細(xì)胞裂解液中加入特定的抗體以及Protein A/G-Beads(預(yù)先將Protein A/G固定結(jié)合在磁珠上),根據(jù)抗原與抗體、Protein A/G與抗體的Fc的特異性,形成“抗原-抗體-Protein A/G-Beads”復(fù)合物,清洗離心后去除溶液中未結(jié)合的雜蛋白,檢測(cè)是否存在目的蛋白。
免疫沉淀技術(shù)常用于從細(xì)胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測(cè)或其他檢測(cè)技術(shù)的蛋白和其他生物分子。它的目標(biāo)是分離足夠用于Western Blot或其他檢測(cè)方法檢測(cè)的蛋白質(zhì)。
免疫沉淀技術(shù)Co-IP的優(yōu)缺點(diǎn)是什么?溫州ChIP免疫沉淀選磁珠還是瓊脂糖珠

免疫沉淀技術(shù)Co-IP實(shí)驗(yàn)步驟。蘇州IP免疫沉淀實(shí)驗(yàn)視頻

Co-IP(Co-Immunoprecipitation,共免疫沉淀)的實(shí)驗(yàn)方法通常包括以下步驟:
1. 細(xì)胞培養(yǎng)與裂解:細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)拿芏取?/span>
蛋白質(zhì)分離:裂解后的細(xì)胞混合物通過(guò)離心去除未破碎的細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞。收集上清液
2. 抗體的添加:將特異性抗體(針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體)加入到裂解物中。
3. 免疫復(fù)合物的形成:抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合后,形成免疫復(fù)合物。
4. 親和介質(zhì)的使用:向混合物中添加蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子(如瓊脂糖或磁性珠子)。
5. 免疫復(fù)合物的捕獲:將混合物與珠子孵育一段時(shí)間后,使用磁鐵或離心的方法將珠子收集起來(lái),同時(shí)捕獲了與之結(jié)合的免疫復(fù)合物。
6. 洗滌:洗滌珠子以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他分子。
7. 洗脫:使用適當(dāng)?shù)木彌_液將免疫復(fù)合物從珠子上洗脫下來(lái),常用的緩沖液包括SDS樣品緩沖液,用于后續(xù)的電泳分析。
8. 蛋白質(zhì)分析:洗脫的蛋白質(zhì)可以通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳、Western blot、質(zhì)譜分析等方法進(jìn)行進(jìn)一步分析。
9. 實(shí)驗(yàn)對(duì)照:實(shí)驗(yàn)中應(yīng)包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
10. 數(shù)據(jù)分析:對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,確認(rèn)目標(biāo)蛋白是否成功沉淀,并鑒定任何可能的相互作用蛋白。
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標(biāo)簽: 支原體 免疫沉淀