gRNA的長(zhǎng)度和錯(cuò)配: 17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的gRNA顯示出更高的基因組編輯效率。相比之下,18-20 bp的長(zhǎng)度顯示出較低的基因組編輯效率。在人類細(xì)胞中減少潛在脫靶效應(yīng)的指導(dǎo)方針:1) 應(yīng)避免在PAM的7-10 bp范圍內(nèi)靶序列有超過3個(gè)錯(cuò)配;2) 在PAM的12 bp內(nèi),應(yīng)避免sgRNA 凸起以減少脫靶效應(yīng)。gRNA的化學(xué)修飾:在gRNA核糖磷酸骨架中加入2?-O-甲基-3?-膦?;宜狨?huì)導(dǎo)致位點(diǎn)特異性修飾,使脫靶切割減少40-120倍,同時(shí)保持靶向性能。gRNA上游5'發(fā)夾結(jié)構(gòu)的修飾可以提高Cas9和Cas12的特異性,降低脫靶效應(yīng)。影響CRISPR靶向性效率和特異性的因素有哪些?杭州脫靶檢測(cè)政策
如果基因zhiliao產(chǎn)品通過全身給xingfang式遞送,長(zhǎng)期隨訪中的安全性監(jiān)測(cè)不僅包括靶qiguan或靶組織的脫靶活性,而且還應(yīng)包括可能發(fā)生在其他組織和qiguan中的脫靶活性?;蚪M整合性或者脫靶活性的分析通常需采用有創(chuàng)性12檢測(cè)方法取得樣本,實(shí)施時(shí)還需要考慮技術(shù)和倫理上的可行性,例如靶向視網(wǎng)膜或肝臟等組織的基因zhiliao產(chǎn)品,可能難以對(duì)靶細(xì)胞采樣,這種情況下可能需要通過密切的臨床隨訪等方式間接評(píng)估風(fēng)險(xiǎn);同時(shí),選擇易于采樣的替代細(xì)胞也可能提供關(guān)于相關(guān)信息,例如靶向骨髓造血干細(xì)胞的基因zhiliao產(chǎn)品,可以通過采集外周血細(xì)胞或富集外周血干細(xì)胞進(jìn)行觀察。武漢育種脫靶檢測(cè)分析種子脫靶檢測(cè),推薦唯可生物,實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng),專業(yè)性高,檢測(cè)效率高,結(jié)果準(zhǔn)確率高。
先導(dǎo)編輯器:CBE和ABE組合使用可以有效地進(jìn)行4種堿基轉(zhuǎn)換(C→T, G→A, A→G, T→C),而無(wú)需產(chǎn)生DSB,然而除了這4種堿基轉(zhuǎn)換,對(duì)另外8種堿基轉(zhuǎn)換(C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A, T→G)以及堿基的插入和缺失,依然缺乏有效的研究工具。先導(dǎo)編輯器(Prime Editor, PE),PE在不依賴DSB和供體DNA的條件下便可有效實(shí)現(xiàn)所有12種堿基轉(zhuǎn)換,此外還能有效實(shí)現(xiàn)多堿基的精細(xì)插入(較多可插入44bp)和刪除(較多刪除80bp)。> 抗CRISPR蛋白。抗CRISPR(Acr)蛋白是天然的CRISPR/Cas系統(tǒng)抑制劑,由各種可移動(dòng)遺傳元件(MGEs)編碼,在不同階段抑制CRISPR-Cas的免疫功能。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多達(dá)45個(gè)Acr蛋白,其中 "AcrIIA4 "有可能保護(hù)細(xì)胞免受編輯。Shin和他的同事發(fā)現(xiàn),通過調(diào)整AcrIIA4或Cas9加入實(shí)驗(yàn)的時(shí)間,AcrIIA4將脫靶修飾減少了4倍,而沒有減少靶向效應(yīng)。
細(xì)胞經(jīng)基因修飾后會(huì)改變其生物學(xué)特性,同時(shí)也會(huì)帶來新的安全性風(fēng)險(xiǎn),如基因編輯脫靶風(fēng)險(xiǎn)、載體插入突變風(fēng)險(xiǎn)、載體重組風(fēng)險(xiǎn)、表達(dá)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)等。細(xì)胞經(jīng)基因修飾后會(huì)改變其生物學(xué)特性,同時(shí)也會(huì)帶來新的安全性風(fēng)險(xiǎn),如基因編輯脫靶風(fēng)險(xiǎn)、載體插入突變風(fēng)險(xiǎn)、載體重組風(fēng)險(xiǎn)、表達(dá)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)等?;诨蛐揎椉?xì)胞的產(chǎn)品種類繁多、各有特點(diǎn),除上述一般技術(shù)要求外,還應(yīng)基于產(chǎn)品的性進(jìn)行相應(yīng)的特殊考慮。本指導(dǎo)原則列舉了以下三種情形的特殊考慮??梢耘c靶基因之外的其他基因作用而非特異性阻斷基因表達(dá),即產(chǎn)生非靶基因的沉默效應(yīng)。
CAR或TCR修飾的免疫細(xì)胞對(duì)于嵌合抗原受體(Chimericantigenreceptor,CAR)或T細(xì)胞受體(Tcellreceptor,TCR)修飾的免疫細(xì)胞,應(yīng)盡可能采用多種方法評(píng)估其靶點(diǎn)相關(guān)毒性和脫靶毒性風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于靶點(diǎn)相關(guān)毒性,應(yīng)采用體外方法深入分析靶點(diǎn)在人體qiguan、組織和細(xì)胞中的表達(dá)分布情況,基因表達(dá)分析庫(kù)和文獻(xiàn)調(diào)研也可能會(huì)有助于闡明靶點(diǎn)在不同病理生理狀態(tài)下的表達(dá)是否存在差異。應(yīng)采用表達(dá)和不表達(dá)靶抗原的細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行體外試驗(yàn),確認(rèn)CAR或TCR修飾的免疫細(xì)胞可特異性的識(shí)別和殺傷靶細(xì)胞。對(duì)于CAR修飾的免疫細(xì)胞,應(yīng)采用多種體外方法評(píng)估其胞外抗原識(shí)別區(qū)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。脫靶檢測(cè)服務(wù),推薦唯可生物,實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng),專業(yè)性高,檢測(cè)效率高,結(jié)果準(zhǔn)確率高。寧波脫靶檢測(cè)企業(yè)
針對(duì)已經(jīng)獲得的有切割能力的sgRNA,需要進(jìn)一步明確其體內(nèi)脫靶效應(yīng)。杭州脫靶檢測(cè)政策
基因編輯產(chǎn)品除了適用基因zhiliao產(chǎn)品的一般考慮以及整合性載體的特殊考慮外,長(zhǎng)期隨訪中還應(yīng)額外關(guān)注脫靶風(fēng)險(xiǎn),量化評(píng)估脫靶活性和在靶活性之間的相關(guān)性,或利用在靶活性來預(yù)測(cè)脫靶活性的水平。在開發(fā)過程中應(yīng)同時(shí)關(guān)注基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、脫靶效率、插入突變情況、目的基因在靶細(xì)胞中整合位點(diǎn)及表達(dá)。評(píng)估基因zhiliao產(chǎn)品整合進(jìn)基因組的可能性,判斷是否需要開展另外的遺傳毒性研究,評(píng)估插入突變(插入位點(diǎn)、插入拷貝數(shù)等)引起的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。需要關(guān)注脫靶編輯、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座印跡引起的遺傳毒性問題;鑒定/表征基因組整合位點(diǎn)。非臨床研究是藥物開發(fā)的重要環(huán)節(jié)之一。杭州脫靶檢測(cè)政策