細(xì)胞轉(zhuǎn)染:(1)轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備A.將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。B.震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩,。(2)選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質(zhì)體體積:DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,再次震蕩。(3)將混合液在室溫放置10—15分鐘。(4)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。(5)加入混合液,將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。(6)到時(shí)后,根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液,之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染是完成這一過程的必需步驟。成都正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑推薦廠家
細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法:人工脂質(zhì)體法原理:帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物,進(jìn)而可被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染/瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染。這種方法幾乎適用于所有細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率高、重復(fù)型好,但轉(zhuǎn)染時(shí)需要去除血清,轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大。實(shí)驗(yàn)步驟:在單獨(dú)試管中分別稀釋核酸及轉(zhuǎn)染試劑→脂質(zhì)體與核酸的磷酸骨架結(jié)合,形成復(fù)合物→脂質(zhì)體上的正電荷有助于復(fù)合物與細(xì)胞膜結(jié)合→復(fù)合物通過內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿→分析細(xì)胞瞬時(shí)基因表達(dá)或沉默情況。成都細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪里買震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染那些事兒:1.選擇傳代次數(shù)較低并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對(duì)大多數(shù)細(xì)胞而言,均需要在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前現(xiàn)在鋪板,第二天上午進(jìn)行轉(zhuǎn)染,48h后收集細(xì)胞進(jìn)行功能檢測(cè)。對(duì)于原代細(xì)胞,可用促有絲分裂刺激物進(jìn)行細(xì)胞活化。2.對(duì)于貼壁細(xì)胞,一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,用胰酶處理為單細(xì)胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,較好在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一次新鮮培養(yǎng)液。3.支原體污染會(huì)嚴(yán)重降低細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率,且支原體不會(huì)像細(xì)菌污染那么明顯,因而轉(zhuǎn)染前可用環(huán)丙沙星處理細(xì)胞以除去支原體。
如何高效率實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染:陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑,以其適用宿主范圍廣,操作簡(jiǎn)便,對(duì)細(xì)胞毒性小,轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。脂質(zhì)體(liposome)是一種人工膜,在水相中形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的球形封閉囊泡。脂質(zhì)體可以和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后重新形成復(fù)合物,當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí),通過內(nèi)吞作用形成內(nèi)體(endosomes)進(jìn)入細(xì)胞,通過緩沖液的作用以及脂質(zhì)與內(nèi)體膜融合,增大內(nèi)體的內(nèi)部滲透壓,使內(nèi)體結(jié)構(gòu)破壞,釋放出核酸。隨后DNA復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。對(duì)于普通細(xì)胞系,一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法較重要的就是防止其毒性,因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例,細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素,通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化合適的轉(zhuǎn)染條件對(duì)于轉(zhuǎn)染效率的提高很重要。一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(很長(zhǎng)轉(zhuǎn)染)。
具有細(xì)胞毒性極低、轉(zhuǎn)染后細(xì)胞存活率高,生成可信任的生理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)。2.操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間,只需對(duì)X-tremeGENE9DNA轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行簡(jiǎn)單稀釋,再與質(zhì)粒DNA共同孵育,即可直接向細(xì)胞添加反應(yīng)混合物(有無血清均可)。3.對(duì)于常用細(xì)胞無需進(jìn)行費(fèi)時(shí)費(fèi)力的優(yōu)化工作。X-tremeGENEHPDNA轉(zhuǎn)染試劑簡(jiǎn)介:X-tremeGENEHPDNA轉(zhuǎn)染試劑是一種高效的無動(dòng)物源成分的低毒轉(zhuǎn)染試劑,兼容含血清或不含血清的培養(yǎng)基,可用于轉(zhuǎn)染各類真核細(xì)胞(包括昆蟲細(xì)胞)以及多種難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。優(yōu)勢(shì):轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)幾個(gè)名詞是從事生命科學(xué)研究的初學(xué)者經(jīng)常碰到的。成都正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑推薦廠家
在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中往往都含有一個(gè)報(bào)告基。成都正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑推薦廠家
轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng):細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。一般轉(zhuǎn)染時(shí),貼壁細(xì)胞密度為70%-90%,懸浮細(xì)胞密度為2×106-4×106細(xì)胞/ml時(shí)效果較好。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長(zhǎng)滿或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感,所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。在三種不同密度進(jìn)行細(xì)胞鋪板的比較表明鋪板密度較高的,CAT活性也較高。得到較高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應(yīng)增加了。這些結(jié)果說明,對(duì)于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的較佳陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑的量會(huì)因細(xì)胞密度而異成都正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑推薦廠家