細胞電轉(zhuǎn)染實驗的幾點建議:1.電場強度要合適合適的電場強度對于電轉(zhuǎn)染實驗非常重要,電場強度不能過高,過高會增加細胞的死亡率;也不能過低,過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細胞系具有不同的較佳場強值,實驗前應(yīng)測定所轉(zhuǎn)染細胞系的較佳電場強度。2.細胞狀態(tài)要好用于電轉(zhuǎn)的細胞一般選取處于對數(shù)生長期的細胞(15代以內(nèi),傳代后2d)。因為處于對數(shù)生長期的細胞分裂旺盛,表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細胞差,電轉(zhuǎn)后,細胞膜的恢復(fù)能力強,而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA~操作簡便,對細胞毒性小,轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。金華正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家推薦
轉(zhuǎn)染的注意事項:培養(yǎng)基中的物品物品,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,使物品可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品,甚至在準備轉(zhuǎn)染前進行細胞鋪板時也要避免使用物品。這樣,在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,因為這些物品是GENETICIN選擇性物品的競爭性克制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長,使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量。大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體,原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化,融化一管新鮮的細胞可能會恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如,新鮮融化的NIH3T3細胞比傳代8次的細胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率,融化細胞的進一步傳代并沒有降低轉(zhuǎn)染效率。因此,如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復(fù)較佳結(jié)果。鄭州細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家直銷當復(fù)合物接近細胞膜時,通過內(nèi)吞作用形成內(nèi)體進入細胞。
細胞轉(zhuǎn)染實驗注意事項:1.如為貼壁生長細胞,一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,必須應(yīng)用胰酶處理成單細胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,轉(zhuǎn)染當日的細胞密度以70-90%(貼壁細胞)或2×106-4×106細胞/ml(懸浮細胞)為宜,較好在轉(zhuǎn)染前4h換一次新鮮培養(yǎng)液。2.用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無蛋白質(zhì),無RNA和其他化學(xué)物質(zhì)的污染,OD260/280比值應(yīng)在1.8以上。3.培養(yǎng)基中的血清在開始準備DNA和陽離子脂質(zhì)體試劑稀釋液時要使用無血清的培養(yǎng)基,因為血清會影響復(fù)合物的形成。其實,只要在DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時不含血清,在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。
細胞電轉(zhuǎn)染實驗的幾點建議:1.電場強度要合適合適的電場強度對于電轉(zhuǎn)染實驗非常重要,電場強度不能過高,過高會增加細胞的死亡率;也不能過低,過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細胞系具有不同的較佳場強值,實驗前應(yīng)測定所轉(zhuǎn)染細胞系的較佳電場強度。2.細胞狀態(tài)要好用于電轉(zhuǎn)的細胞一般選取處于對數(shù)生長期的細胞(15代以內(nèi),傳代后2d)。因為處于對數(shù)生長期的細胞分裂旺盛,表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細胞差,電轉(zhuǎn)后,細胞膜的恢復(fù)能力強,而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA對于真核生物,轉(zhuǎn)染就是原核生物中轉(zhuǎn)化的同義詞。
細胞轉(zhuǎn)染的注意事項:血清A、DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時不能含血清,因為血清會影響復(fù)合物的形成。B、一般細胞對無血清培養(yǎng)可以耐受幾個小時沒問題,轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)液可以含血清也可以不加,但血清一度曾被認為會降低轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對條件進行優(yōu)化。C、對于對血清缺乏比較敏感的細胞,可以使用營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基,或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對血清缺乏比較敏感的貼壁細胞,建議使用**轉(zhuǎn)染試劑。有條件的話,可以用無血清培養(yǎng)基代替PBS洗細胞兩遍,注意洗的時候要輕,靠邊緣緩緩加入液體,然后不要吹吸細胞而是轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板讓液體滾動在細胞表面。如果洗的太厲害,細胞又損失一部分,加了脂質(zhì)體后,細胞受影響就更大了,死亡細胞會增多脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷。寧波深圳細胞高效轉(zhuǎn)染試劑
細胞密度以及轉(zhuǎn)染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素。金華正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家推薦
轉(zhuǎn)染的注意事項:培養(yǎng)基中的物品物品,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,使物品可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品,甚至在準備轉(zhuǎn)染前進行細胞鋪板時也要避免使用物品。這樣,在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,因為這些物品是GENETICIN選擇性物品的競爭性克制劑。金華正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家推薦