外泌體的提取主要包括以下幾種方式。一是超速離心法,這是目前外泌體提取較常用的方法。此種方法得到的外泌體量多,但是純度不足,電鏡鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)外泌體聚集成塊,由于微泡和外泌體沒有非常統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn),也有一些研究認(rèn)為此種方法得到的是微泡不是外泌體。二是過濾離心,這種操作簡單、省時(shí),不影響外泌體的生物活性,但同樣存在純度不足的問題。三是密度梯度離心法,用此種方法分離到的外泌體純度高,但是前期準(zhǔn)備工作繁雜,耗時(shí),量少。外泌體檢測作為一種新型的液體活檢熱點(diǎn)技術(shù)已被許多臨床科研機(jī)構(gòu)普遍地應(yīng)用于一些病癥和疾病的無創(chuàng)診斷。外泌體是一種能被機(jī)體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞分泌的直徑大約為30~150nm的具有脂質(zhì)雙層膜的微小膜泡。武漢正規(guī)外泌體提取試劑直銷價(jià)
外泌體的生物學(xué)功能研究中需要分離完整的外泌體顆粒,而傳統(tǒng)超速離心方法步驟繁瑣、硬件要求高、操作難度大。李記生物自主開發(fā)的外泌體快速提取試劑盒,組分經(jīng)過優(yōu)化處理,適用于細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血清、血漿、尿液及其他體液(腦脊液、腹水、羊水、乳汁以及唾液等)中的外泌體提取,并搭配純化過濾裝置,可快速高效地獲得高純度外泌體顆粒。注意事項(xiàng):1.對于待測樣品粘度過大時(shí),可將樣本用4℃預(yù)冷的1×PBS緩沖液進(jìn)行等體積稀釋處理。2.當(dāng)血清、血漿、唾液等樣品收獲的外泌體濃度較高,收獲的外泌體顆粒無法通過EPF柱純化時(shí),可用4℃預(yù)冷的1×PBS進(jìn)行稀釋后再通過EPF柱離心。3.針對外泌體標(biāo)志蛋白(CD63,CD9,CD81等)進(jìn)行Westernblot檢測,可以鑒定所提的外泌體。通過超速離心(120000g/分鐘)20小時(shí)以上才能獲得足夠的外泌體量。武漢正規(guī)外泌體提取試劑直銷價(jià)外泌體提取:免疫分離技術(shù)。
外泌體在肺病進(jìn)程中的作用:肺病細(xì)胞來源外泌體(LCC-exosome)可以通過刺激一些病癥血管的形成來促進(jìn)一些病癥的生長。據(jù)相關(guān)報(bào)道稱,LCC-exosome中的miR-210可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)細(xì)胞中酪氨酸受體激酶A3的含量,促進(jìn)一些病癥血管的生成;而LCC-exosome中的miR-23a則可以通過啟動(dòng)脯氨酰羥化酶及壓制緊密結(jié)合蛋白ZO-1來促進(jìn)肺病的生血管作用。此外,有研究發(fā)現(xiàn),外泌體中的內(nèi)容物可以觸發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。晚期肺病患者血清中外泌體波形蛋白表達(dá)增加,促使人正常支氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)EMT,從而使肺支氣管正常上皮細(xì)胞出現(xiàn)增殖,遷移能力。色譜法。這種方法分離到的外泌體在電鏡下大小均一,但是需要特殊的設(shè)備,應(yīng)用不普遍。
外泌體的提取分離:1、超濾離心。由于外泌體是一個(gè)大小約幾十納米的囊狀小體,大于一般蛋白質(zhì),利用不同截留相對分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜對樣品進(jìn)行選擇性分離,便可獲得外泌體。超濾離心法簡單高效,且不影響外泌體的生物活性,是提取細(xì)胞外泌體的一種新方法。2、磁珠免疫法。外泌體表面有其特異性標(biāo)記物(如CD63、CD9蛋白),用包被抗標(biāo)記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結(jié)合,即可將外泌體吸附并分離出來。磁珠法具有特異性高、操作簡便、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點(diǎn),但是效率低,外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響,不利于下游實(shí)驗(yàn),難以普遍普及。外泌體提取:樣品中大分子不能進(jìn)入凝膠孔,只能沿多孔凝膠粒子之間的空隙通過色譜柱,被流動(dòng)相洗脫出來。
專利申請利用分離培養(yǎng)人尿液來源細(xì)胞并收集培養(yǎng)基來進(jìn)行體外培養(yǎng),直接把外泌體從尿液中沉降下來,無須分離培養(yǎng)人尿液來源細(xì)胞并收集培養(yǎng)基。人尿液來源細(xì)胞的外泌體的獲取方法,是首先分離培養(yǎng)人尿液來源細(xì)胞并收集培養(yǎng)基,將人尿液來源細(xì)胞的培養(yǎng)基通過0.22微米濾膜過濾,以去除大的細(xì)胞殘片以及其它雜質(zhì);然后離心除去細(xì)胞器,留取上清;再使用可截留100KD分子量的膜,通過離心截留上清中的外泌體,截留完成后,使用PBS對膜進(jìn)行洗脫即得到外泌體濃縮液。外泌體的提取方法:密度梯度離心。重慶正規(guī)外泌體提取試劑哪家好
外泌體的提取方法:多聚物沉淀法。武漢正規(guī)外泌體提取試劑直銷價(jià)
外泌體相關(guān)miRNA與肺病的診斷:miRNAs是一類含有20~25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA,能夠通過下調(diào)或壓制靶mRNAs來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá),目前非編碼RNA被普遍發(fā)現(xiàn)存在于NSCLC患者外泌體中,參與一些病癥的形成和演化過程。單個(gè)miRNA可能通過壓制性復(fù)合物與多個(gè)mRNA結(jié)合,從而阻滯整個(gè)生物通路。因此,外泌體的miRNA具有成為NSCLC標(biāo)志物的優(yōu)勢。Chen等在152例肺病患者的研究中初次報(bào)道了循環(huán)游離miRNA的表達(dá),與75例健康者相比,發(fā)現(xiàn)了兩種高表達(dá)的miRNA(miR-25和miR-223)。Rabinonowits等對27例肺病患者和9例健康人的血漿外泌體中12個(gè)miRNA的表達(dá)進(jìn)行了評估,結(jié)果顯示,12個(gè)一些病癥相關(guān)的miRNA*在肺病患者中過度表達(dá)。Cazzoli等收集了30個(gè)血漿樣本,發(fā)現(xiàn)4種外泌體miRNA(miR-378a、-379a、-139-5p、-200b-5p)在肺病患者血清中明顯升高,用于篩查患者與健康人ROC曲線下面積(AUC)為0.908。離心除去細(xì)胞器,留取上清。武漢正規(guī)外泌體提取試劑直銷價(jià)
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