細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法:細(xì)菌轉(zhuǎn)染:原理:對(duì)于用脂質(zhì)體不能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,可以采用細(xì)菌轉(zhuǎn)染??捎糜诘鞍踪|(zhì)過表達(dá)或克制,是臨床研究中較常用的方法。它通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中,可用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞、原代細(xì)胞的穩(wěn)定性轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)步驟:通過基因克隆生成重組細(xì)菌→采用非細(xì)菌法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系,擴(kuò)增并分離得到重組細(xì)菌顆?!兓⒌味?xì)菌液→轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細(xì)胞(含有細(xì)菌特異性的受體)→去除培養(yǎng)物中的細(xì)菌,并加入新鮮培養(yǎng)基→分析細(xì)胞瞬時(shí)基因表達(dá)或沉默情況。通過緩沖液的作用以及脂質(zhì)與內(nèi)體膜融合,增大內(nèi)體的內(nèi)部滲透壓。寧波正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑價(jià)格
細(xì)胞轉(zhuǎn)染:(1)轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備A.將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。B.震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩,。(2)選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質(zhì)體體積:DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,再次震蕩。(3)將混合液在室溫放置10—15分鐘。(4)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。(5)加入混合液,將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。(6)到時(shí)后,根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液,之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。蘇州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家現(xiàn)貨在現(xiàn)生命可續(xù)研究中,大部分的工作是利用基因功能研究來探索生命過程。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng):細(xì)胞狀態(tài)這點(diǎn)非常重要,不要急于求成,一定要讓細(xì)胞處于較佳的生長狀態(tài)再做。有文獻(xiàn)說傳代不要超過17代。細(xì)胞復(fù)蘇后的3代左右時(shí)細(xì)胞狀態(tài)較好,不要用傳了很多代的細(xì)胞去做,細(xì)胞的形態(tài)都會(huì)發(fā)生變化。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體,原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種變化,融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。因此,如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)較佳結(jié)果?;蛘撸瑤追N來源于經(jīng)篩選,轉(zhuǎn)染效率較高細(xì)胞亞系的細(xì)胞系現(xiàn)在有售~
轉(zhuǎn)染技術(shù):國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù),以其適用宿主范圍廣,操作簡便,對(duì)細(xì)胞毒性小,轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。其中樹枝狀聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)的轉(zhuǎn)染性能較佳,但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性,且其合成工藝復(fù)雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機(jī)大分子,每相隔二個(gè)碳個(gè)原子,即每“第三個(gè)原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子,使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(protonsponge)體。這種聚陽離子能將各種報(bào)告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞,其效果好于脂質(zhì)聚酰胺,經(jīng)進(jìn)一步的改性后,其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物,而且它的細(xì)胞毒性低。大量實(shí)驗(yàn)證明,PEI是非常有希望的基因治好載體。目前在設(shè)計(jì)更復(fù)雜的基因載體時(shí),PEI經(jīng)常做為中心組成成分。當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí),通過內(nèi)吞作用形成內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞。
細(xì)胞電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的幾點(diǎn)建議:1.電場強(qiáng)度要合適合適的電場強(qiáng)度對(duì)于電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)非常重要,電場強(qiáng)度不能過高,過高會(huì)增加細(xì)胞的死亡率;也不能過低,過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細(xì)胞系具有不同的較佳場強(qiáng)值,實(shí)驗(yàn)前應(yīng)測定所轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的較佳電場強(qiáng)度。2.細(xì)胞狀態(tài)要好用于電轉(zhuǎn)的細(xì)胞一般選取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞(15代以內(nèi),傳代后2d)。因?yàn)樘幱趯?duì)數(shù)生長期的細(xì)胞分裂旺盛,表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細(xì)胞差,電轉(zhuǎn)后,細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強(qiáng),而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA代細(xì)胞和傳代次數(shù)多的細(xì)胞都不是較佳選擇。蘇州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑平均價(jià)格
瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)DNA轉(zhuǎn)染后,轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在1-4天內(nèi)檢測到。寧波正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑價(jià)格
細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑:1.準(zhǔn)備不足做脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的時(shí)候,在開展正式實(shí)驗(yàn)前要多做預(yù)試驗(yàn),優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括:脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細(xì)胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時(shí)間等等。2.電壓過大做電轉(zhuǎn)的時(shí)候,如果電壓太大,往往會(huì)發(fā)生細(xì)胞大量死亡的情況。不同的細(xì)胞,需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預(yù)實(shí)驗(yàn),多摸索條件。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞來說,其較佳電壓位于250-1250v/cm。另外,就是進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長期。處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞的抗損傷能力是較強(qiáng)的。細(xì)胞濃度應(yīng)該處于5x106到1x107/mL之間。每次轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒應(yīng)該控制在4-6μg,如果﹥10μg,轉(zhuǎn)染效率也較大降低。寧波正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑價(jià)格