光學(xué)顯微鏡從1590年發(fā)明以來，不斷發(fā)展，促進(jìn)生命科學(xué)日新月異的發(fā)現(xiàn)，幫助人類逐層打開生命本質(zhì)的大門。同時(shí)，生命科學(xué)的發(fā)展不斷給光學(xué)顯微鏡提出新的要求，促使成像理論和技術(shù)持續(xù)更新迭代。科學(xué)進(jìn)入21世紀(jì)，人們已經(jīng)不滿足于在體外研究細(xì)胞和組織，需要能夠更真實(shí)地探索生命，在體內(nèi)實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的發(fā)生和變化。此時(shí)，雙光子顯微鏡進(jìn)入了科學(xué)家的視野。在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長波長的光子，然后發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子，其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（圖1）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時(shí)，在波長為350 nm光的激發(fā)下發(fā)出450 nm熒光；而在雙光子激發(fā)時(shí)，可采用700 nm的激發(fā)光得到450 nm熒光。雙光子顯微鏡的應(yīng)用中，該如何選擇以及更好的使用PMT。國內(nèi)布魯克雙光子顯微鏡成像視野是多少

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問題，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高。激光熒光雙光子顯微鏡價(jià)格雙光子顯微鏡可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝。

使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細(xì)胞分辨率對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測(cè)量不透明大腦深處的活動(dòng)；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動(dòng)，但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對(duì)膜電壓變化進(jìn)行成像，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn)，其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。

從雙光子到三光子：科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求，但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光，是通過物鏡匯聚的。

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子過期后，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計(jì)不少于10家以上。即便如此，世界上很多實(shí)驗(yàn)室都搭雙光子，自己搭的好處有很多，首先是便宜，尤其是實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有飛秒激光器，那就更很省錢了。其次是靈活，可以選擇針對(duì)特殊用途的搭配，改動(dòng)也靈活。好處就是可以鍛煉隊(duì)伍，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護(hù)也更加自由。當(dāng)然壞處也不少，首先是操心，特別是第1次搭的時(shí)候，開始要想方案，后來要解決各種實(shí)際問題。其次是花時(shí)間，加上買配件的時(shí)間，比買一臺(tái)現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時(shí)長?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol，大多是老外寫的，中文的較少。其實(shí)完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的，尤其是沒有經(jīng)驗(yàn)的時(shí)候，容易走彎路，多花錢，也多花時(shí)間，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買，在國內(nèi)買這些東西耗時(shí)較長。因此，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗(yàn)，貼出來分享，希望能幫到想自己動(dòng)手的實(shí)驗(yàn)室，雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的；激光雙光子顯微鏡商家電話

優(yōu)勢(shì)來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)。國內(nèi)布魯克雙光子顯微鏡成像視野是多少

雙光子之源：飛秒激光雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。國內(nèi)布魯克雙光子顯微鏡成像視野是多少