在國家自然科學(xué)基金委國家重大科研儀器研制專項《超高時空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統(tǒng)》的支持下，北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所、信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院、動態(tài)成像中心、生命科學(xué)學(xué)院、工學(xué)院聯(lián)合中國人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成跨學(xué)科團隊，歷經(jīng)三年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，并獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰、穩(wěn)定的圖像。原始論文于5月29日在線發(fā)表于自然雜志子刊Nature Methods (IF 25.3)，相關(guān)技術(shù)文檔同步發(fā)表于Protocol Exchange (DOI: 10.1038/protex.2017.048)，并已申請多項。雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為光源；investigator雙光子顯微鏡的成像視野

研究人員通過用不同激光波長并行化激光掃描（wavelengthmultiplexing），增加了相同時間內(nèi)可以成像的體積，并同時保持較高的時間和空間分辨率。通過引入兩種波長不同的鈣信號熒光探針，研究人員將神經(jīng)元群體的活動標記為兩個不同顏色，并同時用兩個不同波長的激光激發(fā)探針，實現(xiàn)了兩個顏色的并行化數(shù)據(jù)記錄。為了實現(xiàn)三維空間成像，研究人員還分別在兩個激光光路上配置了快速變焦系統(tǒng)，分別為電可調(diào)節(jié)透鏡（electricaltunablelens）和空間光調(diào)制器（spatiallightmodulator）。由此，可以同時以10赫茲的速度記錄500微米500微米的10個平面，覆蓋縱深達600微米，涵蓋了從腦皮層第2層到第5層的結(jié)構(gòu)，體積內(nèi)記錄到的神經(jīng)元可以達到2000個以上。進口激光熒光雙光子顯微鏡成像原理雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有較強度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。

在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有較強度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。

Winfried Denk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100 fs脈寬、630 nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺較左邊。科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年，Chris Xu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、有生命體的觀察！國內(nèi)investigator雙光子顯微鏡分辨率是多少

雙光子顯微鏡的探測器,該怎么選用?investigator雙光子顯微鏡的成像視野

激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束經(jīng)照明，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標本焦平面上每一點進行掃描。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測時先聚焦，然后被光探頭收集，轉(zhuǎn)化為信號輸送到計算機進行處理。這個裝置能讓通過探測的只有焦平面上發(fā)出的熒光，使成像更為清晰準確，同時通過改變物鏡的焦距，能對不同焦平面進行掃描，通過計算機繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像。而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。investigator雙光子顯微鏡的成像視野