相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢？它能做到什么普通光學顯微鏡做不到的事情嗎？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、***觀察！由于電磁波的波長越短，粒子性越強，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性。除此之外，因為只有物鏡焦點處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應，所以掃描的精確度極高，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點之外的熒光物質(zhì)消耗。雙光子顯微鏡能夠進行光裂解、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學操縱。國外ultima雙光子顯微鏡成像原理

雙光子顯微鏡的應用由于適合動態(tài)成像，雙光子顯微鏡一經(jīng)問世便很快應用于神經(jīng)科學、遺傳發(fā)育、藥物代謝等領(lǐng)域。雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對***神經(jīng)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子濃度、細胞運動、分子相互作用等進行直接成像監(jiān)測，而且能夠進行光裂解、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學操縱。同時，雙光子顯微鏡能動態(tài)監(jiān)測**在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移，并可對**治療過程中*細胞的變化進行實時觀測和評估。隨著光學技術(shù)、熒光探針技術(shù)、計算機成像技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微技術(shù)會得到更大提升和更廣的應用，未來不僅用于基礎(chǔ)研究，也將擴展到臨床應用。國內(nèi)布魯克雙光子顯微鏡供應商聯(lián)系方式雙光子顯微鏡非常適合對細胞組織進行長時間在體成像。

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而達到逐點掃描的效果。

在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有較強度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。

雙光子之源：飛秒激光雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實例；國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術(shù)

雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。國外ultima雙光子顯微鏡成像原理

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強？生物組織在近紅外波段存在兩個窗口,第1個近紅外窗口對應波長在700nm-900nm,第2個近紅外窗口對應波長在1000nm-1400nm之間。舉例說明就是單晶硅對于可見光幾乎是不透明的，但是對于紅外波段就像是“水晶”一樣通透性很好了。原因有兩點：1.生物組織對紅外光的吸收弱，對可見光吸收強。類似的，平時用手電筒照射手指，會看到手通透紅亮，也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少。2.生物組織對紅外光的散射弱。因為瑞利散射的強度反比于波長λ的四次方。類似的，早晨的太陽非常紅，也就是因為長波長的紅光穿透力更強。這兩點共同導致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強。國外ultima雙光子顯微鏡成像原理