Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經元成像，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經元的感官刺激誘導樹突鈣離子動態(tài)后，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯。值得一提的是，霍華德·休斯醫(yī)學院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強大的多光子介觀顯微鏡，其成像視場達到5毫米，能夠跨多個腦區(qū)進行高速功能成像。根據清華大學單一采購來源的**指導意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍。30年來，雙光子顯微鏡已成為較厚生物組織三維成像中不可或缺的工具。從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。下圖統(tǒng)計了自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量，發(fā)展速度可見一斑。雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?美國熒光激光雙光子顯微鏡原理

新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的成功研制是國家重大科研儀器研制專項的一個碩果。它彰顯了北京大學在生物醫(yī)學成像領域先期布局的前瞻性，鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體、具有學科交叉背景和重要技術創(chuàng)新能力的“中國智造”隊伍。目前，該研發(fā)團隊正在領銜建設“多模態(tài)跨尺度生物醫(yī)學成像”十三五國家重大科技基礎設施，積極參與即將啟動的中國腦科學計劃。可以期待，微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)將為實現(xiàn)“分析腦、理解腦、模仿腦”的戰(zhàn)略目標發(fā)揮不可或缺的重要作用美國investigator雙光子顯微鏡掃描深度雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器。

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當紅的顯微成像技術。激光掃描共聚焦顯微技術，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發(fā)光照射，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射，但通過探測器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說，每個時刻，只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式，一個個點的信號就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發(fā)光波長較長，只有當兩個（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發(fā)出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點，出才會激發(fā)出熒光。也就是說，雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。

細胞內鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當個細胞興奮時，產生了一個電沖動，此時，細胞外的鈣離子流入該細胞內，促使該細胞分泌神經遞質，神經遞質與相鄰的下一級神經細胞膜上的蛋白分子結合，促使這一級神經細胞產生新的電沖動。以此類推，神經信號便一級一級地傳遞下去，從而構成復雜的信號體系，終形成學習、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經元細胞內鈣離子濃度約為50-100nM，而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經遞質的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學活性，而細胞質內鈣離子濃度由鈣離子的內外流平衡所決定，同時也受鈣結合蛋白的影響。細胞外鈣離子內流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等。神經元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現(xiàn)出來，以反映神經元活性。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關的腦細胞。這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍。

實驗從理論和實驗上評估了多焦點v2PE顯微鏡的空間分辨率，并與單光子熒光顯微鏡進行了對比，實驗中v2PE的激發(fā)波長為521 nm，使用放大倍率為100倍的物鏡，尺寸為0.6AU，對直徑100nm的熒光顆粒進行了測試性成像，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177 nm和297 nm，這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點v2PE顯微技術的空間分辨率，模擬計算顯示v2PE點擴散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似，軸向的半高寬較1PE減少，可以提高空間分辨率。雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。美國熒光激光雙光子顯微鏡原理

雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、有生命體的觀察！美國熒光激光雙光子顯微鏡原理

儀器儀表行業(yè)本身是一個加入，產出周期較長的行業(yè)，所以作為業(yè)內廠家，一方面要尋找中、短期市場熱點，另一方面也要在產品、技術研發(fā)方面有長遠的規(guī)劃;目前，nVista，nVoke，3D bioplotte，invivo等產品的產量居世界前列，實驗分析儀器等中產品的市場占比不斷上升，行業(yè)技術上總體已達到的中等國際水平，少數(shù)產品接近或達到當前較高國際水平。在國民經濟運行中，生物科技，醫(yī)藥科技領域內的技術開發(fā)、技術咨詢、技術服務、技術轉讓，實驗室設備、儀器儀表、醫(yī)療器械、計算機、軟件及輔助設備銷售，計算機數(shù)據處理，貨物及技術進出口業(yè)務。 成像平臺： 1. Inscopix自由活動超微顯微成像系統(tǒng) 2. DiveScope多通道內窺鏡系統(tǒng) 3. 雙光子顯微鏡 動物行為學平臺： 1. PiezoSleep無創(chuàng)睡眠檢測系統(tǒng) 2. 自身給藥、條件恐懼、斯金納、睡眠剝奪、跑步機、各類經典迷宮等 神經電生理： 1.NeuroNexus神經電極 2.多通道電生理信號采集系統(tǒng) 3.膜片鉗系統(tǒng) 4.AO功能神經外科臨床電生理平臺 顯微細胞： 1. UnipicK單細胞挑選及顯微切割系統(tǒng) 科研/臨床級3D打印 1. 德國envisionTEC 3D Bioplotter生物打印機 2. 韓國Invivo醫(yī)療級生物打印機等。等設備是提高勞動生產率的倍增器，對國民經濟有著巨大的作用和影響力。美國商業(yè)部地區(qū)技術和標準研究院（NIST）提出的報告稱：美國90年代儀器儀表工業(yè)產值只占工業(yè)總產值的4%，但它對國民經濟（GNP）的影響面卻達到66%。盡管在我國相關政策的引導和支持下，我國儀器儀表行業(yè)得到了飛速發(fā)展。但是從銷售整體上看，我國的儀器儀表行業(yè)還是落后于國際水平的。重點技術缺乏、高精尖產品嚴重依賴進口、儀器儀表產品同質化嚴重、生產工藝落后、研發(fā)能力弱、精度不高等問題的凸顯，為儀器儀表行業(yè)的發(fā)展帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)。美國熒光激光雙光子顯微鏡原理