雙光子熒光顯微成像主要有以下優(yōu)點(diǎn)∶a.光損傷小∶雙光子熒光顯微鏡使用可見光或近紅外光作為激發(fā)光，對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷很小，適合于長(zhǎng)時(shí)間的研究;b.穿透能力強(qiáng)∶相對(duì)于紫外光，可見光或近紅外光具有很強(qiáng)的穿透性，可以對(duì)生物樣品進(jìn)行深層次的研究;c．高分辨率∶由于雙光子吸收截面很小P，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點(diǎn)處的體積約為λ范圍內(nèi);d.漂白區(qū)域很小，焦點(diǎn)以外不發(fā)生漂白現(xiàn)象。e．熒光收集率高。與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器，提高了熒光收集率。收集效率提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度提高。f.對(duì)探測(cè)光路的要求低。由于激發(fā)光與發(fā)射熒光的波長(zhǎng)差值加大以及自發(fā)的三維濾波效果，多光子顯微鏡對(duì)光路收集系統(tǒng)的要求比單光子共焦顯微鏡低得多，光學(xué)系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單。g.適合多標(biāo)記復(fù)合測(cè)量。許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜要比單光子激發(fā)譜寬闊，這樣，可以利用單一波長(zhǎng)的激發(fā)光同時(shí)激發(fā)多種染料，從而得到同一生命現(xiàn)象中的不同信息，便于相互對(duì)照、補(bǔ)充。世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國(guó)和日本，德國(guó)是徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司。美國(guó)嚙齒類多光子顯微鏡

多光子激發(fā)的特點(diǎn)。激發(fā)波長(zhǎng)∶兩個(gè)或多個(gè)光子同時(shí)激發(fā)，激發(fā)波長(zhǎng)是單光子激發(fā)波長(zhǎng)的兩倍或多倍（i.e.紅光能激發(fā)UV探針）。多光子激發(fā)∶依賴于多個(gè)光子同時(shí)到達(dá)的時(shí)間。使用脈沖飛秒激光器（i.e.10-16 seconds），且能提供更高的峰值功率。熒光限制在焦點(diǎn)處，能滿足多個(gè)光子同時(shí)達(dá)到產(chǎn)生多光子吸收。熒光強(qiáng)度正比于（激光強(qiáng)度）n。為什么使用飛秒激光器?多光子激發(fā)需要超快的激光器，皮秒脈沖不能實(shí)現(xiàn)三光子激發(fā)。深度成像需要更高、更窄脈沖輸出功率。多光子激發(fā)光源處于近紅外區(qū)，對(duì)細(xì)胞毒性和光漂白更小。多光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)帶寬足以覆蓋鈦藍(lán)寶石激光器的可調(diào)諧范圍和用于多光子顯微鏡的許多其它激光器的典型中心頻率。

國(guó)內(nèi)顯微鏡制造市場(chǎng)目前斷層嚴(yán)重。目前我國(guó)顯微鏡行業(yè)發(fā)展缺乏技術(shù)沉淀，20年以上經(jīng)營(yíng)積累的企業(yè)十分稀缺，深度精密制造、光學(xué)主要部件設(shè)計(jì)及工藝嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)升級(jí)。目前中國(guó)顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等主要集中在徠卡顯微系統(tǒng)、蔡司、尼康、奧林巴斯等國(guó)外企業(yè)。國(guó)內(nèi)具備生產(chǎn)顯微鏡能力的企業(yè)屈指可數(shù)，若國(guó)內(nèi)顯微鏡企業(yè)能打破技術(shù)壁壘，切入顯微鏡市場(chǎng)，企業(yè)的生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)將騰躍至一個(gè)更高的格局。未來國(guó)產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡替代空間大。目前中國(guó)使用的多光子激光掃描顯微鏡幾乎被徠卡顯微系統(tǒng)、蔡司、尼康和奧林巴斯壟斷。國(guó)內(nèi)有能力開始生產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡的企業(yè)極少，若國(guó)內(nèi)能夠制造出高性能、高可靠性的多光子激光掃描顯微鏡，無(wú)異是會(huì)面臨極大的市場(chǎng)機(jī)遇。

使用MPM對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行成像時(shí)，通過隨機(jī)訪問掃描—即激光束在整個(gè)視場(chǎng)上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時(shí)間。隨機(jī)訪問掃描可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來實(shí)現(xiàn)，其原理是將具有一個(gè)射頻信號(hào)的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過光柵時(shí)發(fā)生衍射。通過射頻電信號(hào)調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向，這樣使用1個(gè)AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描，利用1對(duì)AOD，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問掃描。但是該技術(shù)對(duì)樣本的運(yùn)動(dòng)很敏感，易出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)偽影。目前，快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動(dòng)偽影而被普遍的使用。多光子顯微鏡將生物打印結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確定位和定向到特定的解剖部位，使其能夠在小鼠組織內(nèi)制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)。

因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司 雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測(cè)效率。光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。美國(guó)嚙齒類多光子顯微鏡

多光子顯微鏡的大多數(shù)補(bǔ)償器都采用棱鏡。美國(guó)嚙齒類多光子顯微鏡

2020年，TonmoyChakraborty等人提出了一種加快2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中，物鏡或樣品的緩慢軸向掃描速度限制了體積成像的速度。近年來，通過使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電可調(diào)諧透鏡（ETL）已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速軸向掃描；但是，遠(yuǎn)程聚焦中反射鏡的機(jī)械驅(qū)動(dòng)會(huì)限制軸向掃描速度，ETL會(huì)引入球面像差和更高階像差，從而無(wú)法進(jìn)行高分辨率成像。為了克服這些局限性，該組引入了一種新穎的光學(xué)設(shè)計(jì)，能將橫向掃描轉(zhuǎn)換為可用于高分辨率成像的無(wú)球差的軸向掃描。該設(shè)計(jì)有兩種實(shí)現(xiàn)方式，第一種能夠執(zhí)行離散的軸向掃描，另一種能夠進(jìn)行連續(xù)的軸向掃描。具體裝置如圖3a所示，由兩個(gè)垂直臂組成，每個(gè)臂中都有一個(gè)4F望遠(yuǎn)鏡和一個(gè)物鏡。遠(yuǎn)程聚焦臂包含一個(gè)檢流掃描鏡（GSM）和一個(gè)空氣物鏡（OBJ1），另一個(gè)臂（稱為照明臂）由一個(gè)水浸物鏡（OBJ2）構(gòu)成。將這兩個(gè)臂對(duì)齊，以使GSM與兩個(gè)物鏡的后焦平面共軛。準(zhǔn)直的激光束被偏振分束器反射到遠(yuǎn)程聚焦臂中，GSM對(duì)其進(jìn)行掃描，進(jìn)而使得OBJ1產(chǎn)生的激光焦點(diǎn)進(jìn)行橫向掃描。美國(guó)嚙齒類多光子顯微鏡