2008年錢永健等人由于熒光蛋白（GFP，綠色熒光蛋白）的發(fā)現(xiàn)和使用，獲得了諾貝爾化學(xué)獎，是對熒光成像技術(shù)的一次巨大肯定和推動。光學(xué)成像本身具有高分辨率、高通量、非侵入和非毒性等特點，再與熒光蛋白以及熒光染料等標(biāo)記物在細(xì)胞中的定位與表達(dá)技術(shù)相結(jié)合，使得科學(xué)家可以特異性的分辨生物體乃至細(xì)胞內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)與成分，并且能夠在生命體和細(xì)胞仍具有活性的狀態(tài)下（狀態(tài)）對其功能進(jìn)行動態(tài)觀察。這就使得熒光成像技術(shù)成為了無可替代的，生物學(xué)家現(xiàn)今較為重要的技術(shù)手段之一。目前，大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)和生理學(xué)研究主要還是在離體培養(yǎng)的細(xì)胞體系中研究。然而與細(xì)胞生物學(xué)研究有所不同的是，大腦的功能研究的整體性和原位性顯得更加關(guān)鍵：只研究分離的神經(jīng)元無法解釋神經(jīng)系統(tǒng)的功能和規(guī)律。由于被觀測的信號會受到樣本組織的散射和吸收，根本無法穿透如此深的組織進(jìn)行成像。而雙光子顯微鏡（Two-photonMicroscopy，簡稱TPM）的發(fā)明，則為此類研究帶來了希望。雙光子顯微鏡特有的非線性光學(xué)特性，再加上其工作波長處在紅外區(qū)域等特點，令其在生物體組織內(nèi)的穿透深度較大提高，使得雙光子顯微鏡成為神經(jīng)科學(xué)家進(jìn)行神經(jīng)成像較理想的工具。用雙光子顯微鏡看看你的皮膚有沒有重?zé)ㄐ律?；bruker雙光子顯微鏡分辨率是多少

第二代微型化雙光子熒光顯微鏡 FHIRM-TPM 2.0，其成像視野是該團(tuán)隊于2017年發(fā)布的代微型化顯微鏡的7.8倍，同時具備三維成像能力，獲取了小鼠在自由運動行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動態(tài)功能圖像，并且實現(xiàn)了針對同一批神經(jīng)元長達(dá)一個月的追蹤記錄。在一批“早鳥項目”中，該系統(tǒng)已被多個研究組應(yīng)用于不同的模式動物和行為范式，如小鼠的社交新穎性識別、斑胸草雀受調(diào)控后大腦特定神經(jīng)元變化、新型神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿探針的傳導(dǎo)適應(yīng)性分析以及獼猴三腦區(qū)成像等多項研究。國內(nèi)熒光雙光子顯微鏡應(yīng)用雙光子顯微鏡的應(yīng)用中，該如何選擇以及更好的使用PMT。

后續(xù)實驗使用碘化丙啶(PI)來指示細(xì)胞在7、8、9和10分鐘的延時觀察后的損傷情況，來驗證該光學(xué)系統(tǒng)對活細(xì)胞長期觀察的適用性。在觀察期間，88個焦點以100毫秒的曝光時間，曝光間隔1s照射樣品，激發(fā)強度為3.21×104W/cm2，激發(fā)波長為525nm，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖，(e)-(h)為相應(yīng)的相應(yīng)襯度圖。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s，得到相應(yīng)的(i)-(p)。由圖像可知，延時觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細(xì)胞損傷，對于實際3D延時成像，由于焦平面是移動的，所以預(yù)期細(xì)胞存活時間會更長，可見這是一種在3D在體延時成像中具有很大優(yōu)勢的成像方案。

雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡能夠在細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞水平上對神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子濃度、細(xì)胞運動、進(jìn)行直接成像監(jiān)測。

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù)。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發(fā)光照射，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射，但通過探測器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說，每個時刻，只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式，一個個點的信號就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發(fā)光波長較長，只有當(dāng)兩個（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發(fā)出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點，出才會激發(fā)出熒光。也就是說，雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。雙光子顯微鏡知多少。美國ultima2PPLUS雙光子顯微鏡光子躍遷

由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，適用于長時間的研究。bruker雙光子顯微鏡分辨率是多少

新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的成功研制是國家重大科研儀器研制專項的一個碩果。它彰顯了北京大學(xué)在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域先期布局的前瞻性，鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體、具有學(xué)科交叉背景和重要技術(shù)創(chuàng)新能力的“中國智造”隊伍。目前，該研發(fā)團(tuán)隊正在領(lǐng)銜建設(shè)“多模態(tài)跨尺度生物醫(yī)學(xué)成像”十三五國家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施，積極參與即將啟動的中國腦科學(xué)計劃?？梢云诖?，微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)將為實現(xiàn)“分析腦、理解腦、模仿腦”的戰(zhàn)略目標(biāo)發(fā)揮不可或缺的重要作用bruker雙光子顯微鏡分辨率是多少