剛好雙光子在這兩點具有很大的優(yōu)勢在實際操作中成像的深度和樣品的關系很大，雙光子成像利用高亮度的熒光標記材料，已經有做到mm級別的穿透深度HighqualitycellularTPimagingwithhighsignal-to-backgroundratio(>100)andtissueimagingwithapenetrationdepthof2200μmhavebeenachievedwithP-QDasprobe.ExtremelyHighBrightnessfromPolymer-EncapsulatedQuantumDotsforTwo-photonCellularandDeep-tissueImaging:ScientificReports:NaturePublishingGroup雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?國內激光熒光雙光子顯微鏡成像視野

在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。國外ultima雙光子顯微鏡應用是什么雙光子顯微鏡的原理是什么？

后續(xù)實驗使用碘化丙啶(PI)來指示細胞在7、8、9和10分鐘的延時觀察后的損傷情況，來驗證該光學系統(tǒng)對活細胞長期觀察的適用性。在觀察期間，88個焦點以100毫秒的曝光時間，曝光間隔1s照射樣品，激發(fā)強度為3.21×104W/cm2，激發(fā)波長為525nm，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖，(e)-(h)為相應的相應襯度圖。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s，得到相應的(i)-(p)。由圖像可知，延時觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細胞損傷，對于實際3D延時成像，由于焦平面是移動的，所以預期細胞存活時間會更長，可見這是一種在3D在體延時成像中具有很大優(yōu)勢的成像方案。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡廠家就找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司；

雙光子顯微鏡在各領域研究中已有許多成功實例；生物領域：貝爾實驗室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經元細胞內鈣離子動力學情形。利用雙光子顯微鏡觀察到的現象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。信息領域：美國科學家Rentzepis提出了一種在現有二維光盤的基礎上將數據儲存擴展到三維空間。由于雙光子激發(fā)具有作用精細體積小的特點，避免了層與層之間的互相干擾，較大地提高了數據儲存密度。雙光子顯微鏡已延伸到各個領域研究中，它能對樣品進行三維觀察，其基礎雙光子激發(fā)效應也具有極高的應用價值。我們可以相信，隨著科技不斷發(fā)展，其他技術的不斷結合，雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應用。雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對神經細胞的形態(tài)結構、離子濃度、細胞運動、進行直接成像監(jiān)測。國外激光雙光子顯微鏡光子躍遷

雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應用。國內激光熒光雙光子顯微鏡成像視野

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小，重只2.2克，適于佩戴在小動物頭部顱窗上，實時記錄數十個神經元、上千個神經突觸的動態(tài)信號。在大型動物上，還可望實現多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學斷層、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢，其橫向分辨率達到0.65μm，成像質量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠優(yōu)于目前領域內主導的、美國腦科學計劃重要團隊所研發(fā)的微型化寬場顯微鏡。采用雙軸對稱高速微機電系統(tǒng)轉鏡掃描技術，成像幀頻已達40Hz（256*256像素），同時具備多區(qū)域隨機掃描和每秒1萬線的線掃描能力。此外，采用自主設計可傳導920nm飛秒激光的光子晶體光纖，該系統(tǒng)實現了微型雙光子顯微鏡對腦科學領域較廣泛應用的指示神經元活動的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用。 同時采用柔性光纖束進行熒光信號的接收，解決了動物的活動和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來，與光遺傳學技術的結合，可望在結構與功能成像的同時，精細地操控神經元和神經回路的活動。國內激光熒光雙光子顯微鏡成像視野