2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多,導(dǎo)致傳熱不佳,使融化時(shí)間延長(zhǎng)。3.離心前忘記平衡,導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過多,忘記更換吸頭和吸管,導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。細(xì)胞傳代具體操作:一.傳代前準(zhǔn)備:1.預(yù)熱培養(yǎng)用液:把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。2.用75%酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。3.正確擺放使用的器械:保證足夠的操作空間,不僅便于操作而且可減少污染。4.點(diǎn)燃酒精燈:注意火焰不能太小。二、細(xì)胞傳代:1.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液:取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。2.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞:注意培養(yǎng)瓶取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋,用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面,再在鏡下觀察細(xì)胞。3.將培養(yǎng)瓶放入超凈工作臺(tái)后打開瓶口,同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。4.加入消化液:小心吸出舊培養(yǎng)液,用PBS清洗(沖洗),加入適量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以蓋住細(xì)胞比較好,比較好消化溫度是37℃。5.顯微鏡下觀察細(xì)胞:倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞,若胞質(zhì)回縮,細(xì)胞之間不再連接成片,表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。6.棄去胰蛋白酶液,加入新鮮的培養(yǎng)液終止反應(yīng)。小心吹打成細(xì)胞懸液。無血清培養(yǎng)基適合于需要無血清環(huán)境的細(xì)胞系。寧夏DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基一般多少錢
這些重組蛋白和動(dòng)物來源成分對(duì)生物制品的安全性有很大影響。成本低。主要用途應(yīng)用案例采用199(SLM)、MEM(SLM)和DMEM(SLM)低血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)Vero細(xì)胞、BHK21細(xì)胞和CHO細(xì)胞,新生牛血清用量可以從10%降至3%,減少新生牛血清使用批次和批間差的影響,減少生物制品純化損失,減少由于不確定蛋白或者其它血清組分帶來干擾和差異的風(fēng)險(xiǎn),提高制品安全性。低血清培養(yǎng)基可以在方瓶、3L轉(zhuǎn)瓶、15L轉(zhuǎn)瓶及生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞,在*苗生產(chǎn)中可以達(dá)到低血清高密度的培養(yǎng)效果。低血清培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分優(yōu)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基,易使細(xì)胞增殖迅速,代謝旺盛,代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有不良影響,易產(chǎn)生細(xì)胞老化脫落現(xiàn)象。因此需要適當(dāng)增加換液次數(shù),增加傳代頻率。獲取同樣的細(xì)胞量,用低血清培養(yǎng)基將比用傳統(tǒng)培養(yǎng)基縮短近1/3的時(shí)間,可提高生產(chǎn)效率。采用199(SLM)低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞分泌狂犬*苗病毒,滴度明顯高于采用199培養(yǎng)基傳統(tǒng)培養(yǎng)獲得的滴度。采MEM(SLM)低血清培養(yǎng)基BHK21細(xì)胞,在本實(shí)驗(yàn)情況下12代內(nèi)細(xì)胞形態(tài)和致密度均優(yōu)于MEM培養(yǎng)基傳統(tǒng)培養(yǎng)情況,因而可以預(yù)期其產(chǎn)生的口蹄*、甲肝等*苗生產(chǎn)的病毒產(chǎn)量將提高。低血清培養(yǎng)基用于反應(yīng)器Vero細(xì)胞狂犬*苗的生產(chǎn),實(shí)踐證明效果良好。采DMEM。江蘇MEM細(xì)胞培養(yǎng)基代理商無酚紅培養(yǎng)基適用于對(duì)酚紅敏感的實(shí)驗(yàn)設(shè)置。
每支凍干品中加入1ml上述培養(yǎng)基使其充分溶解,(此培養(yǎng)基為msc-cm培養(yǎng)基原液),然后用上述配制的10%fcs的dmem/f12培養(yǎng)基稀釋msc-cm1和msc-cm2,制備5倍和10倍的msc-cm1和msc-cm2的稀釋培養(yǎng)基。②培養(yǎng)的hdf細(xì)胞達(dá)到80~90%融合后,%胰酶-edta消化,消化后的細(xì)胞用10%fcsdmem/f12培養(yǎng)基以5×104/ml重懸細(xì)胞,并將其接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100μl,37℃5%co2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí);③24h后棄原培養(yǎng)液,各組分別加入100ul步驟①配制的msc-cm1和msc-cm2原液、5x和10x培養(yǎng)基,每個(gè)msc-cm設(shè)3個(gè)平行孔,同時(shí)設(shè)空白培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基孔為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。放入37℃5%co2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h、72h。④各觀察期終止時(shí),按照試劑盒說明書加入10μl/孔mtt液,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸去原液,加入100μl/孔產(chǎn)物溶解液。37度孵育4小時(shí),取出震蕩10min,在酶標(biāo)儀上以570nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。由于mtt可以被活細(xì)胞內(nèi)的線粒體中的一些脫氫酶還原生成結(jié)晶狀的深紫色產(chǎn)物formazan。在特定溶劑(洗滌劑或dmso)存在的情況下,可以被完全溶解。然后通過酶標(biāo)儀可以測(cè)定570nm波長(zhǎng)附近的吸光度。細(xì)胞增殖越多越快,則吸光度越高;本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
相對(duì)便宜,失敗率低,但易造成營(yíng)養(yǎng)成分的流失。高壓**某些培養(yǎng)基(如MEM)可進(jìn)行高壓**,例如清大天一的MEM培養(yǎng)基中的MD605、MD609等。其中不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉,可在高壓**后加入。另外可高壓的谷氨酸鹽(如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)可代替L-谷氨酰胺為保證高壓**的效果,**設(shè)備的驗(yàn)證很關(guān)鍵,可高壓**的培養(yǎng)基在121℃、15psi,15分鐘的條件下完全可達(dá)到**效果及營(yíng)養(yǎng)成分的**小損失,因此不需將**時(shí)間延長(zhǎng)。**大多數(shù)培養(yǎng)基采用~μm孔徑的微孔濾膜進(jìn)行過濾**,并且已成為培養(yǎng)基**的發(fā)展方向,它可低限度地減少培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)損失。細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)存條件一般為2-8℃、密閉、避光保存,但要注意如下幾點(diǎn):1)過濾后的完全培養(yǎng)液,即添加了血清、谷氨酰胺、***等的培養(yǎng)液要盡快使用,一般在2-3周內(nèi)使用完。培養(yǎng)液中的L-谷氨酰胺是不穩(wěn)定的,不同溫度L-谷氨酰胺的降解。2)**后的未加L-谷氨酰胺等添加劑的培養(yǎng)基溶液,一般可在4℃保存6~9個(gè)月,也可冷凍保存,用時(shí)解凍3)高壓**后的培養(yǎng)基應(yīng)置4℃保存,不能因?yàn)槠淇赡褪芨邷囟雎詢?chǔ)存溫度。4)添加某些生長(zhǎng)因子、***等添加物,可能會(huì)改變培養(yǎng)液的儲(chǔ)存條件。DMEM高糖培養(yǎng)基適用于各種細(xì)胞系的培養(yǎng)。
特別是l235的側(cè)鏈與fcγriii的疏水相互作用。在一些推薦實(shí)施方式中,將l235突變?yōu)槠渌被幔貏e是帶電荷的氨基酸(谷氨酸glu,天冬氨酸asp,精氨酸arg,賴氨酸lys)或是存在空間位阻的大基團(tuán)側(cè)鏈氨基酸(苯丙氨酸phe等),可以減弱抗體與fc受體的結(jié)合。在一些推薦實(shí)施方式中,將l234突變?yōu)槠渌被?,特別是影響主鏈構(gòu)象的氨基酸(甘氨酸gly,脯氨酸pro),可以減弱抗體與fc受體的結(jié)合。higg1的p329參與了與hfcγriii的結(jié)合,特別是與fcγriii的疏水相互作用。在一些推薦實(shí)施方式中,將p329突變?yōu)槠渌被?,特別是帶電荷的氨基酸或是不帶電荷的極性氨基酸(絲氨酸ser,蘇氨酸t(yī)hr等),可以減弱抗體與fc受體的結(jié)合。在一個(gè)更加推薦的實(shí)施方式中,對(duì)higg1進(jìn)行l(wèi)234a、l235r、p329d和a330s突變。序列插入在一些實(shí)施方式中,上述序列插入是將將來源于亞型igg1、igg3抗體的cdr插入到igg2抗體或igg4抗體的骨架上。在一個(gè)推薦實(shí)施方式中,將這些cdr插入到igg4抗體的骨架上。在一個(gè)推薦實(shí)施方式中,將這些cdr插入到進(jìn)行了其他所述改造了的、與fc受體的親和力降低的抗體的骨架上。在一個(gè)更加推薦的實(shí)施方式中,將這些cdr插入到進(jìn)行了所述點(diǎn)突變改造的igg1抗體的骨架上。DMEM培養(yǎng)基能夠維持細(xì)胞的代謝活性。新疆基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基
1640培養(yǎng)基提供了細(xì)胞生長(zhǎng)所需的基本營(yíng)養(yǎng)。寧夏DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基一般多少錢
加入無菌-谷氨酰胺溶液規(guī)定體積、無菌%(w/v)碳酸氫鈉溶液規(guī)定體積,加注射用水(20℃~30℃)至規(guī)定體積,混勻。(4)如果必要,用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。(5)溶液應(yīng)在2℃-8℃下避光保存。具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書1)細(xì)胞培養(yǎng)用水一般為三蒸水(經(jīng)石英蒸餾器蒸餾)或超純水,醫(yī)*生產(chǎn)上一般為注射用水。2)建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用,因?yàn)榘b一旦打開,組分可能會(huì)變質(zhì)或因受潮而結(jié)團(tuán)。3)溶解干粉培養(yǎng)基時(shí)先加入終體積90%-95%的培養(yǎng)用水,添加劑加完后再補(bǔ)足。4)如需添加的組分較多時(shí),某一組分完全溶解后,再添加另一組分。5)待培養(yǎng)基完全溶解后再加入碳酸氫鈉,以免產(chǎn)生沉淀。6)所有成分完全溶解后,培養(yǎng)基應(yīng)立即過濾或高壓**,以免產(chǎn)生沉淀或有微生物污染。7)在過濾**時(shí),一般情況下應(yīng)調(diào)pH比所需值低~,因過濾**后,pH值會(huì)升高約。8)在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,建議不加或加少量的***,如血清的濃度較低則所加***的量也要相應(yīng)降低一些。9)建議用1NHCl或1NNaOH來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH,因?yàn)橛锰妓釟溻c來調(diào)對(duì)培養(yǎng)液的滲透壓影響比較大。**培養(yǎng)基的**方法主要有兩種,高壓**及**。與過濾相比,高壓**的工作強(qiáng)度小。寧夏DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基一般多少錢