7.將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。平衡后將離心管放入離心機(jī)中，以1000rpm/min離心5min。8.棄去上清液，加入適當(dāng)體積的培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。9.將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。10.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要時計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細(xì)胞的生長，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。***要做好標(biāo)記。11.繼續(xù)培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2-4h后開始貼附在瓶壁上。注意事項：1.嚴(yán)格的無菌操作2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。細(xì)胞凍存具體操作：一、凍存前準(zhǔn)備1.準(zhǔn)備適量凍存管，做好標(biāo)記后置于4℃冰箱預(yù)冷；2.配制凍存液，一般為用培養(yǎng)液配制10%DMSO；3.梯度凍存盒。二、細(xì)胞凍存：1.按照細(xì)胞傳代步驟1-7操作制備細(xì)胞懸液并離心；2.棄去上清，加入適當(dāng)體積的凍存液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；3.將1ml細(xì)胞懸液加入加入之前已做好標(biāo)記的凍存管中并做好記錄。DMEM高糖培養(yǎng)基的配方適合大多數(shù)細(xì)胞類型。河北減血清細(xì)胞培養(yǎng)基

    2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時間延長。3.離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。細(xì)胞傳代具體操作：一.傳代前準(zhǔn)備：1.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。2.用75％酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。二、細(xì)胞傳代：1.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。2.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意培養(yǎng)瓶取出細(xì)胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細(xì)胞。3.將培養(yǎng)瓶放入超凈工作臺后打開瓶口，同時要在酒精燈上燒口消毒。4.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞比較好，比較好消化溫度是37℃。5.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時細(xì)胞消化適度。6.棄去胰蛋白酶液，加入新鮮的培養(yǎng)液終止反應(yīng)。小心吹打成細(xì)胞懸液。江蘇基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基代理商DMEM培養(yǎng)基適用于各類細(xì)胞的初級培養(yǎng)。

    552851)、apc-cy7mouseanti-human-cd16(bdbiosciences，557758)、pemouseanti-human-cd56(bdbiosciences，555516)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。結(jié)果討論試驗組擴(kuò)增獲得的細(xì)胞中cd3-cd56+的nk細(xì)胞占比為％(圖10a)，高于對照組獲得的％(圖10b)。在這群細(xì)胞中，cd3-cd16+cd56+的nk細(xì)胞占比分別是％(圖10c)和％(圖10d)。那么，在總細(xì)胞群中，利用試驗組擴(kuò)增獲得的cd3-cd16+cd56+的nk細(xì)胞可達(dá)到總細(xì)胞的％，優(yōu)于用對照組獲得的％。結(jié)果顯示，利用試驗組抗體獲得的nk細(xì)胞產(chǎn)品的純度更高。三、細(xì)胞產(chǎn)品應(yīng)用應(yīng)用實例1nk細(xì)胞產(chǎn)品對腫*細(xì)胞的體外殺傷活力檢測本測試用培養(yǎng)實例3中的試驗組擴(kuò)增獲得的nk細(xì)胞產(chǎn)品(試驗組)和對照組擴(kuò)增獲得的nk細(xì)胞產(chǎn)品(對照組)分別對淋巴*細(xì)胞系raji、乳腺*細(xì)胞系bt-474、乳腺*細(xì)胞系mcf7進(jìn)行直接殺傷和adcc殺傷試驗，通過對終產(chǎn)品活力分析來比較改造抗體和原型抗體的活力。材料：raji細(xì)胞(atcc，ccl-86)，bt-474細(xì)胞(atcc，crl-3247)，mcf7細(xì)胞(atcc，htb-22)，檢測試劑盒cytotoxnon-radioactivecytoto***cityassay(promega，g1780)，培養(yǎng)基rpmi1640(thermofisher，11879020)，利妥昔單抗ritu***mab，曲妥珠單抗trastuzumab。檢測方法傳代培養(yǎng)腫*細(xì)胞。

    一般情況下應(yīng)調(diào)pH比所需值低～，因過濾**后，pH值會升高約。8）在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，建議不加或加少量的***，如血清的濃度較低則所加***的量也要相應(yīng)降低一些。9）建議用1NHCl或1NNaOH來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，因為用碳酸氫鈉來調(diào)對培養(yǎng)液的滲透壓影響比較大。如下圖所示：圖6-1MEM培養(yǎng)基（SLM，MD611）在pH值相同情況下所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對應(yīng)的培養(yǎng)液滲透壓圖6-2199培養(yǎng)基（MD502）在pH值相同情況下所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對應(yīng)的培養(yǎng)液滲透壓培養(yǎng)基**培養(yǎng)基的**方法主要有兩種，高壓**及um微孔濾膜過濾**。與過濾相比，高壓**的工作強(qiáng)度小，相對便宜，失敗率低，但易造成營養(yǎng)成分的流失。高壓**某些培養(yǎng)基（如MEM）可進(jìn)行高壓**，例如清大天一的MEM培養(yǎng)基中的MD605、MD609等。其中不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，可在高壓**后加入。另外可高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）可代替L-谷氨酰胺。為保證高壓**的效果，**設(shè)備的驗證很關(guān)鍵，可高壓**的培養(yǎng)基在121℃、15psi，15分鐘的條件下完全可達(dá)到**效果及營養(yǎng)成分的**小損失，因此不需將**時間延長。過濾**大多數(shù)培養(yǎng)基采用～μm孔徑的微孔濾膜進(jìn)行過濾**，并且已成為培養(yǎng)基**的發(fā)展方向。1640培養(yǎng)基常用于抗體生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)。

    然后是肝部，在一些推薦實施方式中，上述免*細(xì)胞產(chǎn)品用于肺*和肝*的***。nk細(xì)胞表面富表達(dá)fcγriii(cd16)，是adcc作用的主要效應(yīng)細(xì)胞。在一些實施方式中，nk細(xì)胞可與***用抗體聯(lián)合用于adcc殺傷研究。在一些推薦實施方式中，nk細(xì)胞產(chǎn)品可與***用抗體利妥昔單抗ritu***mab聯(lián)合用于淋巴*的***。在一些推薦實施方式中，nk細(xì)胞產(chǎn)品可與***用抗體曲妥珠單抗trastuzumab聯(lián)合用于乳腺*和胃*的***。在一些推薦實施方式中，nk細(xì)胞產(chǎn)品可與***用抗體西妥昔單抗cetu***mab聯(lián)合用于頭頸部*和結(jié)直腸*的***。nk細(xì)胞還可以通過非自我或是自失效應(yīng)(missing-self)來識別和殺傷目標(biāo)。這種細(xì)胞殺傷是非mhc限制性的(non-mhc-restrictedcytoto***city)，不會引起移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease,gvhd)，因此，nk細(xì)胞可應(yīng)用于異體移植***。在一些更加推薦的實施方式中，上述高純度的nk細(xì)胞產(chǎn)品和car-nk細(xì)胞產(chǎn)品用于人同源異體細(xì)胞***，但可以理解，用于同源異體細(xì)胞***的細(xì)胞產(chǎn)品不限于此。以下通過具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。MEM培養(yǎng)基是細(xì)胞生物學(xué)研究中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基之一。甘肅1640RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基

DMEM高糖培養(yǎng)基在生物研究中非常重要。河北減血清細(xì)胞培養(yǎng)基

    lnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplysargvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproalaproglualaarggly0glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasngly0lysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuaspserproileglulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpropro0valleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys4503449prt人工序列。河北減血清細(xì)胞培養(yǎng)基