乙二胺四乙酸:(EDTA)是一種有機(jī)化合物,常溫常壓下為白色粉末。它是一種能與Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二價(jià)金屬離子結(jié)合的螯合劑。動物細(xì)胞在粘附的時(shí)候,需要有Ca或Mg離子的參與,EDTA與他們結(jié)合后,導(dǎo)致動物細(xì)胞粘附能力降低,再加上胰蛋白酶的消化作用,使得細(xì)胞與瓶壁快速脫離。兩者起到了協(xié)同消化的作用。難消化的細(xì)胞,胰酶中可填加EDTA。EDTA對細(xì)胞貼壁性有影響,因此使用時(shí)要甚重。如果影響貼壁,但消化時(shí)必須要用,那么在用完全培養(yǎng)基終止消化后,可離心棄上清,再加完全培養(yǎng)基培養(yǎng),可去除EDTA。如果對貼壁沒影響,那么可不離心。變色的胰酶同樣能很好的用于細(xì)胞的解離,請放心使用。云南胰酶常見問題
胰蛋白酶**初在牛的胰腺中被發(fā)現(xiàn),現(xiàn)在已經(jīng)擴(kuò)展到多種來源,包括哺乳動物(人、牛、豬和狗)、無脊椎動物和微生物等。胰蛋白酶的商業(yè)化生產(chǎn)主要依賴哺乳動物的胰腺組織提取或者重組表達(dá)提取。直接從哺乳動物胰腺組織中提取的缺點(diǎn)是生產(chǎn)成本高,易造成其他結(jié)構(gòu)相近的蛋白污染。重組表達(dá)提取胰蛋白酶可以縮短提取時(shí)間、降低生產(chǎn)成本,提取的蛋白純度高,通過優(yōu)化重組表達(dá)體系可以提高蛋白的表達(dá)量,這些優(yōu)勢為其在醫(yī)療、食品等行業(yè)中的應(yīng)用提供了更多的可能性。[1]折疊黑龍江胰酶價(jià)格對比消化液經(jīng)過過濾除菌,可以直接用于培養(yǎng)細(xì)胞的消化,或者一些組織的消化。
細(xì)胞傳代消化時(shí)所用胰酶的濃度越高是越好 貼壁細(xì)胞的消化: 常用的消化方法主要有酶消化法、離子螯合劑、物理法和冷凍法。其中**常用的是酶消化法。酶消化法:貼壁干細(xì)胞酶消化傳代時(shí)通常采用兩種方式:1、加入胰酶等干細(xì)胞脫落后,再加培養(yǎng)基中止胰酶作用,離心傳代;2、加入胰酶后,鏡下觀察待干細(xì)胞開始脫落時(shí),棄去胰酶,加入培養(yǎng)液并分瓶。但前者太麻煩,而后者有可能對干細(xì)胞施加胰酶選擇,因?yàn)榭偸琴N壁不牢的干細(xì)胞先脫落。
1、胰酶是,就是說PBS,注意,盡量不要用水來溶,因?yàn)橐3譂B透壓。2、EDTA的工作液溶度是-,根據(jù)細(xì)胞消化的難易程度自己調(diào)整。EDTA并不是必須的,容易消化的細(xì)胞可不加。EDTA對細(xì)胞貼壁性有影響,因此使用時(shí)要甚重。如果影響貼壁,但消化時(shí)必須要用,那么在用完全培養(yǎng)基終止消化后,可離心棄上清,再加完全培養(yǎng)基培養(yǎng),可去除EDTA。如果對貼壁沒影響,那么可不離心。3、EDTA的濃度也是質(zhì)量體積比。和胰酶一起溶于PBS。4、注意,血清可終止胰酶的作用,但不能終止EDTA的作用,對有些細(xì)胞來說,終止消化后的離心是必要的。5、胰酶和EDTA在pH為8左右的時(shí)候**易溶解,在配制時(shí)可先滴幾滴NaOH將pH調(diào)至8,注意,胰酶可使溶液變酸,所以要邊溶邊測pH,隨時(shí)調(diào)整。注意,不可加過量NaOH,否則過堿,細(xì)胞會受不了。6、胰酶EDTA相對比較難溶,可用磁力攪拌器,或放入4度冰箱過夜,待溶解后過濾**。7、可配2-3乘的胰酶,這樣比較節(jié)約時(shí)間和濾器,用的時(shí)候?qū)ι?*PBS即可。8、儲存液放在-20度冰箱凍存,使用液放在4度,用的時(shí)候不要放在27度水浴鍋溫浴,因?yàn)檫@樣會讓胰酶很快失效,使用前放在室溫下一會。不同的組織需要消化的時(shí)間相差很大,通常以消化后可以充分打散組織為宜。
在253nm的波長處測定吸光度,必要時(shí)可用上述底物原液或磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié),使吸光度在~,作為底物溶液。制成后應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用。供試品溶液的制備精密稱取本品適量,加~60胰蛋白酶單位的溶液。測定法取底物溶液,加μl,混勻,作為空白。另取供試品溶液200μl,加底物溶液(恒溫于℃±℃),立即計(jì)時(shí),混勻,使比色池內(nèi)的溫度保持在25℃±℃,照紫外-可見分光光度法(2010年版*典二部附錄ⅣA),在253nm的波長處,每隔30秒鐘讀取吸光度,共5分鐘。以吸光度為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo),作圖;每30秒鐘吸光度的改變應(yīng)恒定在~,呈線性關(guān)系的時(shí)間不得少于3分鐘。若不符合上述要求,應(yīng)調(diào)整供試品溶液的濃度,再作測定。在上述吸光度對時(shí)間的關(guān)系圖中,取成直線部分的吸光度,按下式計(jì)算:式中P為每1mg供試品中含胰蛋白酶的量,單位;A1為直線上終止的吸光度;A2為直線上開始的吸光度;T為A1至A2讀數(shù)的時(shí)間,分;W為測定液中含供試品的量,mg;,吸光度每分鐘改變,即相當(dāng)于1個(gè)胰蛋白酶單位。胰蛋白酶制劑注射用胰蛋白酶[3]胰蛋白酶胰蛋白酶的醫(yī)學(xué)檢查胰蛋白酶檢查名稱胰蛋白酶胰蛋白酶分類血液生化檢查>酶類測定胰蛋白酶胰蛋白酶的測定原理同酶速率法測定。胰酶細(xì)胞消化液(不含EDTA)消化細(xì)胞時(shí)間不宜過長,否則細(xì)胞鋪板后生長狀況會較差。河南胰酶市場報(bào)價(jià)
胰酶用0.05%還是0.25%的?需不需要含酚紅的?云南胰酶常見問題
0.25%胰酶和加了EDTA胰酶區(qū)別是什么詳細(xì)說明
細(xì)胞之間是通過CAM(細(xì)胞粘性分子)相連的,而很多粘性分子只有在有+2價(jià)金屬離子,如Ca2+,Mg2+,的存在下才能行使這種功能。EDTA是鈣離子的鰲合劑,在胰酶中加入EDTA的作用簡單的說就是為了增加胰酶的消化作用,尤其適用于比較難于消化的細(xì)胞;同時(shí)可以減少胰消化時(shí)間,以減少酶對細(xì)胞的損傷作用。加入EDTA的消化反應(yīng)不能通過加入培養(yǎng)液終止,必須離心才能去除EDTA,所以要掌握好消化時(shí)間。 云南胰酶常見問題