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南京Co IP免疫沉淀技術(shù)服務

來源： 發(fā)布時間：2024-05-31

免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation, IP）的實驗步驟通常包括以下幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)：
1. 細胞裂解：首先需要收集細胞并裂解它們，以釋放細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。這通常通過添加含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液來完成，以防止蛋白質(zhì)降解。
2. 裂解物上清：裂解后的細胞混合物通常需要通過離心來去除未破碎的細胞碎片和未裂解的細胞，從而獲得上清。
3. 抗體的添加：將特定于目標蛋白的抗體加入到裂解物中。這些抗體將特異性地結(jié)合到目標蛋白上。
4. 免疫復合物的形成：抗體與目標蛋白結(jié)合形成免疫復合物。
5. 免疫復合物的捕獲：使用Protein A/G結(jié)合的磁珠來捕獲免疫復合物。
6. 洗滌：捕獲免疫復合物后，需要用裂解/洗滌緩沖液多次洗滌，以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他污染物。
7. 洗脫：免疫復合物可以通過加入SDS樣品緩沖液進行洗脫，這將導致抗體和抗原變性并從珠子上釋放下來，或者使用低pH緩沖液進行溫和洗脫，以保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。
8. 分析：洗脫后的樣品可以通過SDS-PAGE凝膠電泳、Western blot等方法進行分析，以驗證目標蛋白的存在和狀態(tài)。
免疫沉淀技術(shù)Co-IP的應用有哪些？南京Co IP免疫沉淀技術(shù)服務

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免疫沉淀（Co-IP）實驗中抗體的選擇非常關(guān)鍵，因為抗體的特異性和親和力直接影響到實驗的成功與否。
1. 特異性：抗體應當對目標蛋白具有高度的特異性，以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，導致假陽性結(jié)果。
2. 親和力：抗體對目標蛋白的親和力要足夠高，以確保在免疫沉淀過程中能夠有效地捕獲目標蛋白。
3. 抗體類型：單克隆抗體和多克隆抗體都可以用于IP實驗。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性，而多克隆抗體可能提供更強的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應用驗證：選擇已經(jīng)過免疫沉淀（Co-IP）或相關(guān)應用（如Western blot, IHC）驗證的抗體，這增加了實驗成功的可能性。
5. 供應商信息：選擇信譽良好的抗體供應商，并查看供應商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評價，以幫助做出決策。
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“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的結(jié)合蛋白，進行小規(guī)模的蛋白質(zhì)親和純化的實驗。更確切地說，IP是采用固定在微珠支持物(一般是瓊脂糖樹脂)上的特定抗體，從復雜的混合物中，純化單一抗原的實驗。固定化蛋白質(zhì)復合物的組裝既可以分步進行，也可以一步完成。

常見的加樣順序：抗體和樣本(如細胞裂解物)一起孵育，然后加入親和微珠，用于捕獲抗體-抗原復合物。也可以將抗體和微珠(通過抗體結(jié)合蛋白，如蛋白A、G或A/G等，直接或間接結(jié)合抗體)先進行孵育，然后再加入含有抗原的樣本。當抗原、抗體和固相支持物產(chǎn)生結(jié)合以后，充分洗滌微珠，再采用適當?shù)南疵摼彌_液從支持物上洗脫抗原。

免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation, IP）的實驗方法通常包括以下步驟：
1. 樣本準備
2. 蛋白質(zhì)濃度測定：使用BCA、Bradford或Lowry等方法測定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度。
3. 抗體預處理：如果使用預固定的抗體，需先將抗體固定在固相支持物上，如瓊脂糖珠或磁性微珠。
4. 免疫沉淀反應：將裂解液與特異性抗體（固定或未固定）混合，并在4°C下緩慢搖晃孵育過夜，以允許抗體與目標蛋白質(zhì)充分結(jié)合。
5. 固相支持物的回收：對于未固定的抗體，加入與抗體特異性結(jié)合的蛋白A或蛋白G結(jié)合的固相支持物。
6. 洗滌：去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)，通常需要多次洗滌固相支持物。
7. 洗脫：使用適當?shù)南疵摼彌_液（如加熱的SDS加載緩沖液或酸性緩沖液）從固相支持物上洗脫免疫復合物。
8. 后續(xù)分析：對洗脫的蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE電泳、Western Blot、質(zhì)譜分析等，以進一步分析目標蛋白質(zhì)。
免疫沉淀技術(shù)ChIP實驗步驟。

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免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation，簡稱IP）是一種生物學實驗方法，用于從細胞或組織裂解物中分離和純化特定蛋白質(zhì)。這項技術(shù)依賴于抗體的高度特異性，通過抗體與目標蛋白質(zhì)的結(jié)合，實現(xiàn)對目標蛋白質(zhì)的富集和純化。
具體操作步驟通常包括以下幾個階段：裂解細胞或組織，抗體與蛋白質(zhì)結(jié)合，固相支持物的使用，免疫復合物的捕獲，洗滌，洗脫分析。
免疫沉淀技術(shù)不僅可以用于檢測蛋白質(zhì)的存在和量，還可以用于研究蛋白質(zhì)的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)的功能等。此外，免疫沉淀技術(shù)是許多其他高級實驗技術(shù)的基礎(chǔ)，如染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-Seq）和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析等。
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免疫沉淀純化所得抗原量低有多種原因，
A. 純化所得抗原量低
1. 抗原結(jié)合水平低
IP 應用中出現(xiàn)低抗原結(jié)合水平的可能原因有很多，結(jié)合反應所使用的溶液是重要原因之一。必須使用適合的緩沖液，有特定的pH和鹽濃度，可能還需要添加互作所需的輔助因子。IP 或Co-IP 中用于純化的抗體是影響得率的另一個重要因素。如果抗體本身易失活或與抗原結(jié)合微弱，則可能很難找到足夠溫和的條件，即能產(chǎn)生結(jié)合，又能保證在孵育和洗滌過程中結(jié)合可以穩(wěn)定保持。
2. 抗原洗脫水平低
在某些情況下，抗原與抗體或結(jié)合蛋白結(jié)合之間可能會發(fā)生極強的相互作用，傳統(tǒng)的洗脫緩沖液無法將其破壞。如果需要使用溫和洗脫緩沖液收集功能性抗原，則上述矛盾尤為突出。

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