免疫沉淀(IP)的原理及應(yīng)用:
免過疫沉淀技術(shù)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ),用于研究蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)與遺傳物質(zhì)之間相互作用的經(jīng)典方法,可有效確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用,也是用于抗原檢測和純化的方法之一。CO-IP、CHIP、RIP等技術(shù)由IP演化而來。
原理:IP利用特定抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合,將其從混合物中沉淀出來,實現(xiàn)蛋白的純化與鑒定。
作用:富集和檢測某單一蛋白。
應(yīng)用:主要用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究,幫助分析蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成。IP側(cè)重于研究蛋白質(zhì)復(fù)合物,適用于探究特定蛋白質(zhì)的結(jié)合伙伴以及信號通路的研究。 Co-IP實驗檢測:制備樣品、裂解細胞、免疫沉淀、WB檢測!蛋白蛋白互作檢測CoIP WB
免疫共沉淀實驗的注意事項主要包括以下幾點:樣品的準(zhǔn)備:樣品的準(zhǔn)備是非常關(guān)鍵的步驟。要保證細胞處于適當(dāng)?shù)纳L狀態(tài)下,避免細胞過度生長或死亡。同時,要確保細胞表達所需的蛋白質(zhì),可以通過轉(zhuǎn)染等方法引入外源基因??贵w的選擇:抗體的選擇對于免疫共沉淀實驗至關(guān)重要。要確保使用的抗體特異性高,能夠識別目標(biāo)蛋白質(zhì),并且與其它蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)小。此外,抗體的來源和親和性也需要考慮,以確保實驗結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。細胞裂解條件:細胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。同時,裂解液中要加入各種酶抑制劑,以防止蛋白質(zhì)降解。共沉淀的驗證:在免疫共沉淀實驗中,需要確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白。此外,要驗證抗體的特異性,即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀。另外,需要確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中,而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的,這需要進行蛋白質(zhì)的定位來確定。實驗的重復(fù)性:由于免疫共沉淀實驗的靈敏度和特異性可能受到多種因素的影響,因此建議進行多次重復(fù)實驗,以驗證結(jié)果的可靠性。蛋白蛋白互作檢測CoIP WBCo-IP和ChIP基本原理方面的區(qū)別有什么。
Co-IP技術(shù),即免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation),是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。該技術(shù)基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理,通過特異性抗體將目標(biāo)蛋白及其相互作用伙伴一同沉淀下來,從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)復(fù)合物的富集和分離。Co-IP技術(shù)具有操作簡便、特異性高、靈敏度強等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域,尤其在探索信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、疾病發(fā)生機制等方面具有重要意義。在實驗中,通常選擇特異性強的抗體與磁珠或瓊脂糖等固相載體偶聯(lián),然后將細胞或組織裂解液與抗體-載體復(fù)合物混合,通過洗滌和洗脫等步驟,獲得與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物。這些復(fù)合物可進一步通過質(zhì)譜分析等方法進行鑒定和驗證,為研究蛋白質(zhì)相互作用提供有力支持。
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)實驗是一種生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù),用于檢測和鑒定在細胞內(nèi)發(fā)生蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的復(fù)合物。該實驗依賴于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理,通過特定抗體來捕獲并富集與目標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物。在免疫共沉淀實驗中,首先需要將細胞或組織在適當(dāng)?shù)牧呀鈼l件下破碎,釋放出其中的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)中,許多會通過非共價鍵(如氫鍵、疏水作用、離子鍵等)或共價鍵(在某些情況下)相互作用形成復(fù)合物。然后,向裂解物中加入針對目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性抗體,這些抗體會與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物。接下來,利用與抗體結(jié)合的親和劑(如ProteinA、ProteinG或特定種類的瓊脂糖珠),通過免疫親和反應(yīng)將抗原-抗體復(fù)合物捕獲并固定在固相支持物上。在經(jīng)過一系列洗滌步驟后,可以去除與固相支持物非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì),從而將目標(biāo)蛋白質(zhì)及其相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物富集在固相支持物上。通過適當(dāng)?shù)南疵摲椒▽⒏患牡鞍踪|(zhì)復(fù)合物從固相支持物上洗脫下來,并進行后續(xù)的分析。蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子互作實驗方法介紹。
CoIP-Mass是一種檢測細胞內(nèi)蛋白互作組的套餐技術(shù)。該技術(shù)通過聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)和質(zhì)譜檢測技術(shù),對目的蛋白在特定細胞/組織內(nèi)的互作蛋白,進行系統(tǒng)的檢測和分析。該技術(shù)適用于目的蛋白在特定細胞/組織中的蛋白互作組數(shù)據(jù)檢測,或用于不同遺傳背景/實驗條件下的互作組差異研究。因此,該技術(shù)是研究細胞內(nèi)蛋白互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的常規(guī)前置技術(shù)。CoIP-WB是一種檢測細胞內(nèi)蛋白互作的驗證技術(shù)。該技術(shù)通過聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)和WesternBlot蛋白檢測技術(shù),對目的蛋白在特定細胞/組織內(nèi)的互作關(guān)系進行探究,明確蛋白直接的相互作用關(guān)系。該技術(shù)適用于目的蛋白在特定細胞/組織中的蛋白互作檢測驗證,或用于不同遺傳背景/實驗條件下的互作差異研究。因此,該技術(shù)是研究細胞內(nèi)蛋白互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的常規(guī)檢測技術(shù)。Co-IP研究蛋白間互作,ChIP研究蛋白與DNA互作,實驗原理各具特色!蛋白蛋白互作檢測CoIP WB
IP-WB(免疫沉淀-Western Blot)技術(shù)應(yīng)用場景。蛋白蛋白互作檢測CoIP WB
IP-Mass(免疫沉淀-質(zhì)譜)技術(shù)是一種結(jié)合了免疫沉淀和質(zhì)譜分析的方法,用于研究蛋白質(zhì)相互作用和差異蛋白質(zhì)分析。該技術(shù)首先利用特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合,形成抗原-抗體復(fù)合物。然后,這些復(fù)合物被吸附到固相載體上,經(jīng)過洗滌步驟去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。接下來,蛋白質(zhì)復(fù)合物從載體上洗脫下來,并通過質(zhì)譜分析進行鑒定和檢測。質(zhì)譜分析是IP-Mass技術(shù)的重要部分,它可以提供關(guān)于蛋白質(zhì)的質(zhì)量、荷質(zhì)比和豐度等信息。通過對質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析,可以鑒定出與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì),以及蛋白質(zhì)之間的相互作用強度和特異性。IP-Mass技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用價值。它不僅可以用于研究蛋白質(zhì)相互作用,還可以用于差異蛋白質(zhì)分析,例如在疾病發(fā)生和發(fā)展過程中蛋白質(zhì)表達譜的變化。蛋白蛋白互作檢測CoIP WB