Real-time PCR鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。外源DNA污染。確保操作的潔凈。陰性對照出現(xiàn)條帶：試劑，頭，工作臺污染。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔。條帶大小與理論不符：污染。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔。模板或引物使用錯誤。更換引物和模板?；騺喰?。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)較廣用于表達譜，以確定基因的表達或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。武漢血液PCR檢測技術(shù)供應(yīng)商

PCR的反應(yīng)條件：dNTP濃度過高會加快反應(yīng)速度，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，低則合成產(chǎn)物量減少。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸，一個30個循環(huán)的擴增反應(yīng)0.1%-0.25%總錯誤率。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結(jié)合。引物長度在15～25時退火溫度。熱啟動/冷完成聚合酶鏈反應(yīng)是通過新的雜合聚合酶實現(xiàn)的，這些酶在環(huán)境溫度下不活躍。深圳血液PCR檢測技術(shù)方案因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高，所以相應(yīng)的對引物設(shè)計的要求就很高。

Real-time PCR的染料法和探針法的選擇：進行mRNA表達量的測定，采用染料法是比較經(jīng)濟實惠的；染料法可以通過比較熔解曲線的熔解峰位置得到產(chǎn)物特異性的情況；目的基因和內(nèi)參基因分管檢測，染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX，探針法主要應(yīng)用于病毒RNA的檢測；以及單位點突變（SNP）；多基因的合并檢測，探針法還可用于同一個反應(yīng)中同時檢測目的基因和內(nèi)參基因的情況；而染料法則必須分管檢測。Real-time PCR：實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡稱Real-time PCR）是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實時熒光定量在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見”，之后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進行定量的方法。

Real-time PCR原理：所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。DNA結(jié)合染料法，應(yīng)用一種帶有熒光的、非特異的DNA結(jié)合染料檢測PCR過程中積累的擴增產(chǎn)物。檢測所有雙鏈DNA擴增產(chǎn)物，包括非特異反應(yīng)產(chǎn)物，如引物二聚體。可對任何雙鏈DNA進行定量；不需要探針，因此減少了實驗設(shè)計及運轉(zhuǎn)成本；適合于大量基因的分析；簡單易用。實時熒光定量PCR：實時熒光定量PCR（QuantitativeReal-time PCR）是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。Real-time PCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。Real-time PCR的基本目標是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸。

Real-time PCR：基線（baseline)：通常是3－15個循環(huán)的熒光信號，同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線。閾值（threshold)：自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。手動設(shè)置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。Ct值：與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系，分析定量時候一般取Ct:15-35.太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準確。相對定量：通過與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來計算基因之間的表達差異,一般是2-△△Ct?；蛘呤强紤]擴增效率的Pfaffl法。聚合酶鏈式反應(yīng)又稱多聚酶鏈式反應(yīng)。上海血液定量PCR技術(shù)服務(wù)

Real-time PCR探針法實驗結(jié)果穩(wěn)定重複性好，特異性更高。武漢血液PCR檢測技術(shù)供應(yīng)商

聚合酶鏈式反應(yīng)的試驗污染：陽性對照，在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本，如以重組質(zhì)粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定。武漢血液PCR檢測技術(shù)供應(yīng)商

上海司鼎生物科技有限公司擁有從事生物科技領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)開發(fā)、技術(shù)轉(zhuǎn)讓、技術(shù)咨詢、技術(shù)服務(wù)，營養(yǎng)健康咨詢服務(wù)，商務(wù)咨詢，計算機軟件開發(fā)，化工原料及產(chǎn)品（除危險化學(xué)品、監(jiān)控化學(xué)品、煙花爆竹、易制毒化學(xué)品），實驗室設(shè)備，儀表儀器的銷售。 【依法須經(jīng)批準的項目，經(jīng)相關(guān)部門批準后方可開展經(jīng)營活動】等多項業(yè)務(wù)，主營業(yè)務(wù)涵蓋免疫印跡（WB)技術(shù)服務(wù)，熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，膜片鉗電生理技術(shù)服務(wù)，在體光纖成像記錄技術(shù)服務(wù)。公司目前擁有專業(yè)的技術(shù)員工，為員工提供廣闊的發(fā)展平臺與成長空間，為客戶提供高質(zhì)的產(chǎn)品服務(wù)，深受員工與客戶好評。上海司鼎生物科技有限公司主營業(yè)務(wù)涵蓋免疫印跡（WB)技術(shù)服務(wù)，熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，膜片鉗電生理技術(shù)服務(wù)，在體光纖成像記錄技術(shù)服務(wù)，堅持“質(zhì)量保證、良好服務(wù)、顧客滿意”的質(zhì)量方針，贏得廣大客戶的支持和信賴。公司力求給客戶提供全數(shù)良好服務(wù)，我們相信誠實正直、開拓進取地為公司發(fā)展做正確的事情，將為公司和個人帶來共同的利益和進步。經(jīng)過幾年的發(fā)展，已成為免疫印跡（WB)技術(shù)服務(wù)，熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，膜片鉗電生理技術(shù)服務(wù)，在體光纖成像記錄技術(shù)服務(wù)行業(yè)出名企業(yè)。