Real-time PCR鏈式反應(yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。聚合酶鏈式反應(yīng)準備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。使用Real-time PCR進行基因檢測,被普遍應(yīng)用于病毒和病原菌檢測基因檢測等領(lǐng)域。廈門分子生物學(xué)定量PCR服務(wù)

所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，之后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應(yīng)管中能實時地監(jiān)測反應(yīng)全過程。這兩個發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運用。寧波實時PCR檢測技術(shù)設(shè)計公司實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。

Real-time PCR相對定量中的標準曲線法如何進行：主要是相對定量標準品的制作，一般有三種方法：1、比較復(fù)雜的方法：質(zhì)粒，采用Biotnt提供內(nèi)參基因的特異性Real-time PCRmRNA引物，對目的基因進行Real-time PCR實驗，得到PCR擴增產(chǎn)物；PCR擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入質(zhì)粒中，得到相對定量的標準品；2、一般采用的方法1：比較強的CDNA模板，3、一般采用的方法：PCR擴增產(chǎn)物，如果在方法2中找不到比較強的CDNA模板，則選用PCR產(chǎn)物作為相對定量的標準品也是可以的；需要注意的事項是：PCR產(chǎn)物濃度很高，而Real-time PCR的產(chǎn)物片段比較短，容易在稀釋的過程中造成PCR污染，要注意操作。

Real-time PCR-傳統(tǒng)定量PCR：擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，之后酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。通過使用本產(chǎn)品，可以在更短的時間內(nèi)，簡便、低成本地進行Real-time PCR檢測。

Real-time PCR與普通PCR的實驗?zāi)康牟煌?，所以對引物的設(shè)計要求也不同。普通PCR的實驗?zāi)康闹皇菫榱双@得目的基因產(chǎn)物，允許有非特異擴增，只要目標條帶清晰明亮，就可以通過切膠回收的方法回收目標條帶，之后進行后續(xù)的克隆、測序。但Real-time PCR的目的是為了讓目的基因按照理論值或是按照接近理論值進行擴增，只有這樣的擴增后續(xù)由Ct值推算出的起始量模板量才準確，基于此，Real-time PCR對非特異性擴增和引物二聚體的存在有較嚴格的要求。PCR可能是分子生物學(xué)中使用很較廣的技術(shù)。廈門分子生物學(xué)定量PCR服務(wù)

聚合酶鏈反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液。廈門分子生物學(xué)定量PCR服務(wù)

聚合酶鏈式反應(yīng)又稱多聚酶鏈式反應(yīng)，是一項利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，在生物體外復(fù)制特定DN段的核酸合成技術(shù)。透過這項技術(shù)，可在短時間內(nèi)大量擴增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應(yīng)是是一種簡單，廉價和可靠的方法復(fù)制DN段，這個概念適用于現(xiàn)物學(xué)和相關(guān)科學(xué)的許多領(lǐng)域。PCR可能是分子生物學(xué)中使用很較廣的技術(shù)。這種技術(shù)被用于生物醫(yī)學(xué)研究，犯罪取證和分子考古學(xué)。通常，PCR由一系列20-40次重復(fù)的溫度變化組成，稱為熱循環(huán)，每個循環(huán)通常由兩個或三個離散的溫度步驟組成。聚合酶鏈式反應(yīng)準備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列。廈門分子生物學(xué)定量PCR服務(wù)

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