冷凍電鏡技術(shù)近年來(lái)獲得了迅猛的發(fā)展，取得了許多具有重大意義的成果。冷凍電鏡將生物分子進(jìn)行冷凍便可進(jìn)行高分辨率成像，還具有分辨率高、更接近天然狀態(tài)、適用研究對(duì)象普遍等優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，系統(tǒng)地綜述了冷凍電鏡技術(shù)在科學(xué)研究中的應(yīng)用，并展望冷凍電鏡技術(shù)未來(lái)的發(fā)展。冷凍電鏡（cryo-electronmicroscopy，cryo-EM）技術(shù)，是在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術(shù)，即把樣品冷凍并保持低溫放進(jìn)顯微鏡里面，用高度相干的電子作為光源從上面照射，透過(guò)樣品和附近的冰層，受到散射，再利用探測(cè)器和透鏡系統(tǒng)把散射信號(hào)成像記錄下來(lái)，較后進(jìn)行信號(hào)處理，得到樣品的結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡技術(shù)中的單顆粒分析法在分析具有同質(zhì)性結(jié)構(gòu)的樣品時(shí)表現(xiàn)出更方便、更優(yōu)異的成像能力。杭州冷凍透射電鏡技術(shù)服務(wù)中心

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)：生物大分子快速冷凍后，在低溫下利用透射電子顯微鏡對(duì)結(jié)構(gòu)均一、分散的全同樣品顆粒進(jìn)行成像，再經(jīng)圖像處理及重構(gòu)計(jì)算獲得樣品的三維結(jié)構(gòu)?？裳芯可锎蠓肿釉谌芤褐械慕Y(jié)構(gòu)及構(gòu)象變化、無(wú)需結(jié)晶、所需樣品量相對(duì)較少，適合于蛋白質(zhì)、病毒等生物大分子及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。樣品制備：可以根據(jù)樣品、電鏡載網(wǎng)和其他使用條件，摸索合適的單顆粒樣品制備條件，純化、收集濃度范圍從幾微升50nM至5uM濃度的蛋白溶液來(lái)制備單顆粒電鏡樣品。在-196℃時(shí)，組織中的生物大分子能夠長(zhǎng)期保持穩(wěn)定性、細(xì)胞活性及組織微觀結(jié)構(gòu)，同時(shí)，在低溫下，生物樣品耐受電子輻照劑量增強(qiáng)，且其在電鏡鏡筒的高真空環(huán)境中脫水變形的問(wèn)題也得以解決。Vitrobot和EMGP2均能夠提供快速、簡(jiǎn)單、可重復(fù)的安自動(dòng)化樣品玻璃化制備過(guò)程，其在恒定的物理和機(jī)械條件下（如溫度、相對(duì)濕度、吸濕條件和冷凍速度）對(duì)樣品進(jìn)行冷凍固定確保生物樣品在低溫狀態(tài)下仍保持天然構(gòu)象。上海生物冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)用途冷凍電鏡技術(shù)能夠揭示生物分子細(xì)節(jié)。

低溫冷凍透射電鏡技術(shù)的特點(diǎn)：相對(duì)于常溫透射電鏡，低溫透射電鏡的優(yōu)勢(shì)有：①快速冷凍制樣技術(shù)將樣品固定在玻璃態(tài)的冰層中，避免了水或溶劑結(jié)晶對(duì)樣品結(jié)構(gòu)的破壞，能夠保持液相中有機(jī)分子自組裝體和化學(xué)反應(yīng)中間體的微觀結(jié)構(gòu)，避免了樣品干燥引起的結(jié)構(gòu)變化;②高分子及化學(xué)反應(yīng)體系常常具有非平衡態(tài)結(jié)構(gòu)，快速冷凍制樣技術(shù)能夠保持住非平衡態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而得以觀察;③低溫條件能夠盡可能保持有機(jī)和高分子等軟物質(zhì)材料的微觀結(jié)構(gòu)，明顯減少電子束對(duì)樣品的損傷。

冷凍電鏡技術(shù)基本原理之三維冷凍電鏡技術(shù)：樣品經(jīng)過(guò)在液氮中的冷凍固定，使得生物大分子中的H2O分子以玻璃態(tài)的形式存在，保持低溫，將樣品放入顯微鏡，高度相干的電子作為光源從上面照射下來(lái)，透過(guò)樣品和附近的冰層，受到散射，利用探測(cè)器和透鏡系統(tǒng)把散射的信號(hào)成像記錄下來(lái)，再進(jìn)行信號(hào)處理，較后利用三維重構(gòu)的技術(shù)得到樣品的三維結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)分辨率高：光學(xué)顯微鏡的分辨率為0.2μm，透射電子顯微鏡的分辨率為0.2nm，透射電子顯微鏡在光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上放大了1000倍。冷凍電鏡技術(shù)之冷凍蝕刻電子顯微鏡優(yōu)點(diǎn)：樣品通過(guò)冷凍，可使其微細(xì)結(jié)構(gòu)接近于活的狀態(tài)。

冷凍電鏡技術(shù)中的電子斷層掃描技術(shù)與單顆粒分析法的比較：?jiǎn)晤w粒分析法：它的優(yōu)點(diǎn)：解析生物大分子的理論分辨率可達(dá)原子級(jí)；樣品受總輻射值??；對(duì)稱(chēng)顆粒的解析分辨率更高；分子量越大，結(jié)果越好；電子斷層掃描技術(shù)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單直接；對(duì)樣品的要求較低；常用于對(duì)細(xì)胞或者生物組織結(jié)構(gòu)的三維重構(gòu)；但是，對(duì)同一樣品位置多次拍照時(shí)，電子束對(duì)樣品的輻照損傷就會(huì)成為了比較嚴(yán)重的問(wèn)題；當(dāng)樣品旋轉(zhuǎn)角度受到電子束透過(guò)樣品厚度能力的限制。冷凍電鏡技術(shù)與X射線晶體學(xué)、核磁共振一起構(gòu)成了高分辨率結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。汕頭Cryo-TEM技術(shù)特點(diǎn)

冷凍電鏡技術(shù)主要研究組織、細(xì)胞和微生物中的超微結(jié)構(gòu)。杭州冷凍透射電鏡技術(shù)服務(wù)中心

冷凍電鏡技術(shù)總結(jié)：電子斷層成像技術(shù)則可用來(lái)研究一定厚度的亞細(xì)胞器在天然狀態(tài)下的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，由于樣品厚度的限制，能看到500-1000nm左右厚度的結(jié)構(gòu)，的也可以了解整個(gè)細(xì)胞不同層面的內(nèi)部結(jié)構(gòu).盡管，我們能夠預(yù)言按目前電子冷凍斷層成像技術(shù)的發(fā)展會(huì)得到許多更誘人的信息。細(xì)胞內(nèi)存在大量分子機(jī)器和生物大分子復(fù)合物，并且與單個(gè)超分子相比要大，更容易對(duì)其進(jìn)行識(shí)別。這樣的事實(shí)使斷層技術(shù)的目標(biāo)變得簡(jiǎn)單了。在不久的將來(lái)關(guān)于細(xì)胞骨架，核孔復(fù)合體和核纖層，囊泡聚集和運(yùn)輸復(fù)合物以及其他一些細(xì)胞成分的一些基本問(wèn)題會(huì)得到更清晰的闡釋。這兩種方法都不需要對(duì)樣品進(jìn)行結(jié)晶，快速含水冰凍的制樣過(guò)程既不復(fù)雜，又保存了樣品的瞬時(shí)天然結(jié)構(gòu)，有利于對(duì)復(fù)合物的功能進(jìn)行研究，圖像自動(dòng)化篩選過(guò)程將是今后提高分辨率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而電子晶體學(xué)則對(duì)具有對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的樣品進(jìn)行三維重構(gòu)具有很大的優(yōu)勢(shì)，比如二十面體病毒，螺旋對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)等，尤其適合膜蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并且是電子顯微術(shù)中目前只一能達(dá)到原子分辨率水平的方法。杭州冷凍透射電鏡技術(shù)服務(wù)中心

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