冷凍電子顯微鏡技術(shù)步驟之樣品制備：用于冷凍電鏡研究的生物樣品必須非常純凈。生物樣品是在高真空的條件下成像的，所以樣品的制備既要能夠保持本身的結(jié)構(gòu)又能抗脫水、電子輻射?，F(xiàn)在普遍采用的方法是通過快速冷凍使含水樣品中的水處于玻璃態(tài)，也就是在親水的支持膜上將含水樣品包埋在一層較樣品略高的薄冰內(nèi)。冰的結(jié)構(gòu)多種多樣，包括六角形冰、立方體冰等，其物理狀態(tài)與冷凍速率有關(guān)。若要形成玻璃態(tài)(即無定形態(tài))的冰，需要冷凍速率達到每秒鐘104攝氏度。此時，冰的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)各向同性，不會因成像角度不同而導致圖像產(chǎn)生偏差。該方法有兩個步驟:一是將樣品在載網(wǎng)上形成一薄層水膜:二是將第步獲得的含水薄膜樣品快速冷凍。在多數(shù)情況下，用手工將載網(wǎng)迅速浸入液氮內(nèi)可使水冷凍成為玻璃態(tài)。其優(yōu)點在于將樣品保持在接近生活狀態(tài)，不會因脫水而變形，同時可以減少輻射損傷。冷凍電鏡技術(shù)的獨特優(yōu)勢：冷凍電鏡單粒子法既可以對具有對稱結(jié)構(gòu)的大分子進行研究。深圳生物冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)品牌

冷凍電鏡技術(shù)原理之單顆粒技術(shù)：對分散分布的生物大分子分別成像，基于分子結(jié)構(gòu)同一性的假設(shè)，對多個圖像進行統(tǒng)計分析，并通過對正、加和平均等圖像操作手段提高信噪比，進一步確認二維圖像之間的空間投影關(guān)系后經(jīng)過三維重構(gòu)獲得生物大分子的三維結(jié)構(gòu)方法。其適合的樣品分子量范圍為80~50MD，Zgao分辨率約0.3nm。利用單顆粒技術(shù)獲得三維重構(gòu)的方法主要包括等價線方法、隨機圓錐重構(gòu)法、隨機初始模型迭代收斂重構(gòu)等方法，其基本目標是獲得二維圖像之間正確的空間投影關(guān)系，從而進行三維重構(gòu)。韶關(guān)原位冷凍電鏡技術(shù)用途冷凍電鏡技術(shù)之冷凍蝕刻電子顯微鏡優(yōu)點：可研究細胞內(nèi)的膜性結(jié)構(gòu)及內(nèi)含物結(jié)構(gòu)。

冷凍電子顯微鏡技術(shù)中電子斷層掃描重構(gòu)技術(shù)：電子斷層掃描技術(shù)是從一個物體的投影圖像重構(gòu)獲得物體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的技術(shù)，通過獲取同一物體的多個連續(xù)角度下的二維投影圖來反向重構(gòu)它的三維結(jié)構(gòu)。簡單地說，電子斷層掃描技術(shù)就是將一個物體(樣品)沿著一個與電子束垂直的軸旋轉(zhuǎn)，每旋轉(zhuǎn)一個角度，采集這個物體在相對應(yīng)方向上的二維投影像，通過對這些二維投影圖的處理(相互配準)，將不同角度的二維投影圖反向重構(gòu)(如加權(quán)背投影等方法)，獲得樣品整體三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)。電子斷層成像適合于在納米級尺度上研究不具有結(jié)構(gòu)均一性的蛋白、病毒、細胞器以及它們之間組成的復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)。與電子晶體學和單顆粒技術(shù)相比，這種技術(shù)無需樣品顆粒具有結(jié)構(gòu)同一性，也不強調(diào)樣品具有一定的對稱性。因此，雖然目前電子斷層成像所獲得的結(jié)構(gòu)的分辨率(約4~10納米)不能與以上兩種技術(shù)相比，但其在研究非定形、不對稱和不具全同性的生物樣品的三維結(jié)構(gòu)和功能中有著不可替代的作用。

冷凍電子顯微鏡技術(shù)：目前使用的幾種主要的結(jié)構(gòu)解析方法包括:電子晶體學單顆粒重構(gòu)技術(shù)和電子斷層掃描重構(gòu)技術(shù)等。電子晶體學：電子晶體學技術(shù)利用電子顯微鏡的成像和電子衍射的功能，從生物大分子的二維晶體獲取結(jié)構(gòu)信息，解析其三維結(jié)構(gòu)。生物大分子在空間中有序排列，可以形成三維晶體，也可以形成二維晶體對于二維晶體來說，其只在X-Y平面內(nèi)具有平移對稱性，電子波照射到二維晶體上時能夠發(fā)生衍射。根據(jù)電子顯微鏡記錄的二維圖像來確定相位，利用二維晶體的衍射圖譜來確定振幅，從而通過反傅里葉變換計算出大分子的密度投影，之后再利用三維重構(gòu)技術(shù)獲得大分子的三維結(jié)構(gòu)圖，從而解析出生物大分子的三維結(jié)構(gòu)。該方法的特點是解析分辨率較高，可達到近原子分辨率。但獲得蛋白的二維晶體來作為樣品，仍然是一項非常具有挑戰(zhàn)性的工作。冷凍電鏡技術(shù)之冷凍蝕刻電子顯微鏡優(yōu)點：樣品通過冷凍，可使其微細結(jié)構(gòu)接近于活的狀態(tài)。

冷凍電鏡技術(shù)是什么呢？冷凍電鏡用于生物樣品三維結(jié)構(gòu)解析，包含單顆粒分析、微晶電子衍射和冷凍電子斷層掃描3種技術(shù)。冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)（cryo-EMSPA）是一種以單顆粒形式分析生物分子組裝的新方法，通過將負染電鏡篩選獲得的合適濃度的生物分子樣品快速冷凍，使生物大分子以近天然狀態(tài)存在于無定形冰中，然后進行冷凍樣品的篩選、數(shù)據(jù)收集和三維結(jié)構(gòu)解析，從而獲得高分辨率的生物分子結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)能夠從分子層面進行詳細的研究，解析基于結(jié)構(gòu)的藥物研發(fā)的分子基礎(chǔ)，而冷凍電子斷層掃描能夠從亞細胞水平觀察目標分子在原位細胞環(huán)境中的作用位點和作用機制，相信在不久的將來能夠用于進一步確認基于結(jié)構(gòu)的藥物研究的可靠性。微晶電子衍射不只能夠進行小分子微晶結(jié)構(gòu)解析，也可與現(xiàn)有技術(shù)互補，進行生物大分子及其復(fù)合物的微晶結(jié)構(gòu)解析。冷凍電鏡技術(shù)能夠揭示生物分子細節(jié)。宜昌低溫冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)哪里有

冷凍電鏡技術(shù)能夠提供生理環(huán)境下大分子復(fù)合物納米、亞納米甚至近原子尺度的原位結(jié)構(gòu)信息。深圳生物冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)品牌

冷凍電鏡技術(shù)工作流程：做好前面的工作就需要設(shè)定較佳的參數(shù)（比如：欠焦值、放大倍數(shù)和電子劑量等），記錄這些樣品區(qū)域的大量圖像，用手工或半自動程序框取那些離散的分子形成的投影圖。然后就是三維結(jié)構(gòu)搭建。由于電子可能對非常敏感的樣品造成輻射損傷，所以單顆粒冷凍電鏡只能采用非常低的電子量，而這種電鏡2D投影圖像有非常大的背景噪聲。為提高圖像分辨率，研究人員首先需要提出一個初始的3D模型，然后對捕獲的單顆粒2D圖像進行分選。深圳生物冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)品牌

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