單顆粒冷凍電鏡技術(shù)二維圖像分析——顆粒圖像的匹配與分類：二維顆粒圖像的分類是獲取三維結(jié)構(gòu)過程的第一步。對(duì)二維圖像的分析包括兩部分：顆粒圖像的匹配和顆粒圖像的分類。匹配的過程通常會(huì)對(duì)顆粒圖像應(yīng)用一些變換操作，通過關(guān)聯(lián)函數(shù)去判斷不同顆粒圖像之間的相似程度。圖像匹配的算法主要分為兩種，即不依賴模型的方法和基于模型的方法，取決于是否存在利用樣本先驗(yàn)信息得到的模板。隨著圖像匹配的完成，顆粒圖像需要進(jìn)行分類。主要利用多元統(tǒng)計(jì)分析和主成分分析方法等算法，其他流行的二維顆粒分類技術(shù)還有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類，將圖像在二維空間自組織映射(self-organisingmapping，SOM)再進(jìn)行分類和排序。二維圖像分析的目的是，首先通過圖像匹配消除旋轉(zhuǎn)和平移的誤差，利用類內(nèi)緊致、類間離散的原則進(jìn)行圖像分類，較終可以對(duì)類內(nèi)顆粒圖像進(jìn)行平均，提高信噪比，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)高分辨率三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。冷凍電鏡技術(shù)之冷凍透射電鏡優(yōu)點(diǎn)：加速電壓高，電子能穿透厚樣品。寧波冷凍電鏡單顆粒技術(shù)

冷凍電鏡技術(shù)的儀器結(jié)構(gòu)：（1）圖像記錄系統(tǒng)：收集來自樣品的電子信號(hào)，在熒光屏上形成圖像。（2）電子槍：產(chǎn)生電子束的部分，聚光鏡系統(tǒng)負(fù)責(zé)將電子束聚焦到樣本樣品上。（3）圖像生成系統(tǒng)：由物鏡，中間和投影儀鏡頭以及可移動(dòng)平臺(tái)組成。冷凍電鏡已經(jīng)能解析出生物大分子的原子級(jí)分辨率（0.2-0.3nm）結(jié)構(gòu)，但是這一結(jié)果離物理極限還有較大距離。長久以來，冷凍電鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域取得了巨大成功，目前，多構(gòu)象蛋白的三維分類問題和生物大分子的動(dòng)力學(xué)分析依然是充滿挑戰(zhàn)的研究方向，新型的算法發(fā)展也將主要圍繞這些問題展開。而作為一種低信號(hào)源激發(fā)測試技術(shù)，冷凍電鏡技術(shù)在一些對(duì)電子束、熱敏感材料，如鈣鈦礦材料、某些高分子材料、水凝膠、量子點(diǎn)等精細(xì)結(jié)構(gòu)的物理表征與機(jī)理研究中也具有巨大的應(yīng)用潛力。他山之石，可以攻玉。隨著硬件設(shè)備與模擬算法的改進(jìn)，這項(xiàng)帶著結(jié)構(gòu)生物化學(xué)研究邁入新紀(jì)元的技術(shù)，未來必定擁有更加廣闊的應(yīng)用前景。廈門透射電子顯微鏡技術(shù)服務(wù)電話冷凍電鏡技術(shù)之冷凍蝕刻電子顯微鏡優(yōu)點(diǎn)：冷凍蝕刻的樣品，經(jīng)鉑、碳噴鍍而制備的復(fù)型膜具有很強(qiáng)的立體感。

冷凍電子顯微技術(shù)的發(fā)展與完善經(jīng)歷了復(fù)雜而艱辛的探索，下面，我們將深入解析冷凍電子顯微鏡的工作原理、流程與儀器結(jié)構(gòu)，揭開它的廬山真面目。樣品制備：樣品快速冷凍技術(shù)：樣品的原位冷凍固定處理是低溫電子顯微鏡標(biāo)本制備的開始。冷凍電鏡采用的快速冷凍技術(shù)關(guān)鍵在于“快速”。這是由于：采用常規(guī)冷凍手段，水分子會(huì)在氫鍵作用下形成冰晶，一來會(huì)改變樣品結(jié)構(gòu)，二來在成像過程中，冰晶體會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的電子衍射掩蓋樣品信號(hào)。而當(dāng)冷凍速率足夠快時(shí)，水分子在形成晶體之前就會(huì)凝固成無定形的玻璃態(tài)冰，具有非晶態(tài)特性，保證了在電子束探測成像的過程中不會(huì)對(duì)樣品成像造成干擾。冷凍固定時(shí)，樣品首先放置在由液氮冷卻的容器中，隨后被快速浸入液態(tài)乙烷中。采用液態(tài)乙烷作為冷凍劑的目的是為了使冷凍速率足夠快，在冷凍過程中，樣品將以每秒104至106K的速度被快速冷卻。生物樣品中的水被玻璃化冷凍后，樣品結(jié)構(gòu)就得到了保持和固定，同時(shí)玻璃化冰也不會(huì)在真空環(huán)境中揮發(fā)，在一定程度上保護(hù)了樣品免受電子輻射的損傷。

冷凍電子顯微鏡技術(shù)步驟之圖像采集：冷凍的樣品通過專門的設(shè)備一冷凍輸送器轉(zhuǎn)移到電鏡的樣品室。在照相之前，必須觀察樣品中的水是否處于玻璃態(tài)，如果不是則應(yīng)重新制備樣品。由于生物樣品對(duì)高能電子的輻射敏感，照相時(shí)必須使用較小曝光技術(shù)。經(jīng)過透射電子顯微鏡中一系列復(fù)雜的過程，較終在記錄介質(zhì)上會(huì)形成樣品放大幾千倍至幾十萬倍的圖像。利用計(jì)算機(jī)對(duì)這些放大的圖像進(jìn)行處理分析即可獲得樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。近年來，一個(gè)技術(shù)上的重大突破是高分辨率圖像采集設(shè)備的開發(fā)與應(yīng)用?；诨パa(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)技術(shù)開發(fā)的直接探測電子成像的裝置使電子顯微放大圖像的信噪比相對(duì)過去所使用的底片或電荷耦合元件(CCD)有了很大提高、進(jìn)而提高了成像的質(zhì)量。冷凍電子顯微鏡技術(shù)之樣品成像：低劑量輻照成像，普通樣品材料在進(jìn)行表征時(shí)，電子劑量越高成像質(zhì)量越好。

冷凍電子顯微鏡技術(shù)中單顆粒重構(gòu)技術(shù)：該技術(shù)也叫做單顆粒分析，主要適用于結(jié)構(gòu)具有全同性的生物大分子的結(jié)構(gòu)解析，蛋白質(zhì)的分子量通常要求在100KD以上，在顆粒數(shù)目足夠多的情況下，理論上其分辨率可以達(dá)到原子水平。該方法的圖像處理和三維重構(gòu)計(jì)算過程如下:從原始的電鏡照片中將顆粒圖像挑選出來，對(duì)其進(jìn)行二維圖像對(duì)中、分類和平均，然后通過計(jì)算等價(jià)線的方法推算各分類圖的取向，利用傅里葉重構(gòu)法建立始三維結(jié)構(gòu)模型，通過對(duì)原始圖片或分類平均圖與結(jié)構(gòu)模型投影的匹配，優(yōu)化取向參數(shù)，進(jìn)而得到更準(zhǔn)確的三維結(jié)構(gòu)模型，如此反復(fù)對(duì)初始結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行修正，直到收斂獲得較終的結(jié)果。單顆粒重構(gòu)技術(shù)近年來發(fā)展迅速，應(yīng)用普遍，不斷有文章報(bào)道利用此技術(shù)所獲得的大分子復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡技術(shù)之冷凍掃描電鏡是克服樣品含水問題的一個(gè)快速、可靠和有效的方法。汕頭單顆粒冷凍電鏡技術(shù)哪里有

冷凍電鏡技術(shù)將生物分子進(jìn)行冷凍便可進(jìn)行高分辨率成像，還具有分辨率高等優(yōu)勢。寧波冷凍電鏡單顆粒技術(shù)

冷凍電鏡技術(shù)解析結(jié)構(gòu)主要風(fēng)險(xiǎn)在：A.樣品很不穩(wěn)定，樣品寄送過來的時(shí)候，已經(jīng)降解或者聚集，無法進(jìn)行后續(xù)處理；B.樣品在冷凍制樣的過程中，可能會(huì)被凍碎，從而無法進(jìn)行后續(xù)處理；C.樣品純度可能很好，但是均一度很差，從而難以獲得樣品的高分辨結(jié)構(gòu)；D.我們關(guān)心的區(qū)域可能在整個(gè)復(fù)合體中有很強(qiáng)的柔性，從而經(jīng)過二維或者三維平均后，我們關(guān)心區(qū)域的分辨率會(huì)比較差甚至看不見，達(dá)不到我們的預(yù)期；E.一些配體，比如藥物前體分子，分子量太小，不一定能在電鏡的密度圖中觀測到；F.對(duì)于合適的樣品，我們冷凍制樣需要優(yōu)化的參數(shù)有很多，包括樣品濃度的優(yōu)化，blottime的優(yōu)化，溫度的優(yōu)化，grid規(guī)格（銅網(wǎng)或者金網(wǎng)）的優(yōu)化等一系列條件的優(yōu)化。因此冷凍電鏡制樣需要豐富的經(jīng)驗(yàn)和充足的機(jī)時(shí)支持，不同的實(shí)驗(yàn)者，成功率可能差別很大。寧波冷凍電鏡單顆粒技術(shù)

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