Real-time PCR實驗注意事項-防止RNA酶污染的措施：1.所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。3.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。4.配制的溶液應盡可能的用0.1%DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經0.22μm濾膜過濾除菌。5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。6.設置RNA操作專業(yè)使用實驗室，所有器械等應為專業(yè)使用。Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測。廈門分子生物學熒光定量PCR服務

Real-time PCR與普通PCR的實驗目的不同，所以對引物的設計要求也不同。普通PCR的實驗目的只是為了獲得目的基因產物，允許有非特異擴增，只要目標條帶清晰明亮，就可以通過切膠回收的方法回收目標條帶，之后進行后續(xù)的克隆、測序。但Real-time PCR的目的是為了讓目的基因按照理論值或是按照接近理論值進行擴增，只有這樣的擴增后續(xù)由Ct值推算出的起始量模板量才準確，基于此，Real-time PCR對非特異性擴增和引物二聚體的存在有較嚴格的要求。珠海組織定量PCR原理Real-time PCR反應的一個主要限制是，為了產生其選擇性擴增的引物，需要目標序列的先前信息。

Real-time PCR實驗常用的RNA酶抑制劑：1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。2.異硫氰酸胍：目前被認為是較有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。3.氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態(tài)類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。

Real-time PCR鏈式反應：每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發(fā)展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。多重連接依賴探針擴增允許用單個引物對擴增多個靶標，從而避免多重PCR的分辨率限制。引物的設計注意事項：1，注意引物設計好后的產物長度。Real-time PCR的較佳產物長度在150-250kb左右（書上說這樣可以增加熒光的敏感度，減少實驗誤差，但是我對這個說法持懷疑態(tài)度。產物長度越大，SYBR嵌入的越多，這樣才能夠保證之后的熒光值比較可信）。2，不同的管家基因擴增效率不同。所以在做整個實驗之前應該做一次檢測擴增效率的實驗。如果擴增效率相差太大，就不能使用delt，deltCt法來比較基因表達量的高低。PCR反應的很大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性。

Real-timePCR的反應條件：dNTP濃度過高會加快反應速度，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增，低則合成產物量減少。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸，一個30個循環(huán)的擴增反應0.1%-0.25%總錯誤率。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結合。引物長度在15～25時退火溫度。Real-time PCR主要指在PCR反應體系中加入熒光物質。珠海特殊樣本PCR檢測技術供應商

聚合酶鏈反應的這種能力增強了許多方法，例如生成雜交探針用于雜交。廈門分子生物學熒光定量PCR服務

為了便于對所檢測樣本進行比較，在real-timeQ-PCR反應的指數期，首先需設定一定熒光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號（baseline），熒光域值的缺省設置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數（Ct）。Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環(huán)數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。廈門分子生物學熒光定量PCR服務

上海司鼎生物科技有限公司位于放鶴路1088號。公司業(yè)務涵蓋免疫印跡（WB)技術服務，熒光定量PCR技術服務，膜片鉗電生理技術服務，在體光纖成像記錄技術服務等，價格合理，品質有保證。公司從事醫(yī)藥健康多年，有著創(chuàng)新的設計、強大的技術，還有一批專業(yè)化的隊伍，確保為客戶提供良好的產品及服務。司鼎生物秉承“客戶為尊、服務為榮、創(chuàng)意為先、技術為實”的經營理念，全力打造公司的重點競爭力。