聚合酶鏈反應(yīng):在檢測病原體方面,病原體培養(yǎng)是臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn) .但是對于一些苛養(yǎng)菌 生長緩慢的細(xì)菌或難以培養(yǎng)的病原體等培養(yǎng)的陽性檢出率不高.檢測時間過長 無法滿足臨床早期快速診斷以指導(dǎo)醫(yī)治的需要[3]。當(dāng)前 PCR 技術(shù)是在傳統(tǒng) PCR 技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)上進行的改進,包括實時定量 PCR 技術(shù) 、 實時熒光定量PCR、 PCR-酶聯(lián)免疫吸附試驗 、 巢式PCR等。 在PCR技術(shù)的輔助作用下,實驗室檢測也逐漸從生化免疫診斷過渡到基因診斷,生化免疫檢測主要從表型表現(xiàn)評估病癥,而基因診斷則深入本質(zhì)探究其病因,以PCR 技術(shù)為主的核酸技術(shù)在臨床實驗室檢測與疾病診斷中表現(xiàn)出了明顯的應(yīng)用價值,在未來的臨床醫(yī)學(xué)檢驗中必將會得到更加較廣的應(yīng)用。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象,可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、菌類等。寧波血液定量PCR網(wǎng)站
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備:PCR引物設(shè)計:PCR反應(yīng)中有兩條引物,即5′端引物和3′引物。設(shè)計引物時以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)(常以信息鏈為基準(zhǔn)),5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。引物設(shè)計的基本原則:引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC很好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。連云港特殊樣本定量PCR設(shè)計公司序列間特異性聚合酶鏈反應(yīng)放大簡單重復(fù)序列之間的區(qū)域,以產(chǎn)生擴增片段長度的獨特指紋。
聚合酶鏈反應(yīng)同時擴增單個精子中幾個基因座的能力]增強了極大地增強了通過研究減數(shù)分裂后染色體交叉來進行基因定位的傳統(tǒng)任務(wù)。通過分析數(shù)千個單個精子,已經(jīng)直接觀察到非常緊密基因座之間罕見的交叉事件。類似地,可以分析異常的缺失、插入、易位或倒位,所有這些都無需等待(或支付)漫長而艱苦的受精、胚胎發(fā)生等過程。定點突變:聚合酶鏈反應(yīng)可用于產(chǎn)生突變基因,突變由科學(xué)家隨意選擇??梢赃x擇這些突變來理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的,并改變或改善蛋白質(zhì)功能。
逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的原理是:提取組織或細(xì)胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增,而獲得目的基因或檢測基因表達。完整RNA 的提取和純化,是進行RNA 方面的研究工作,如Nothern雜交、mRNA 分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。所有RNA的提取過程中都有五個關(guān)鍵點,即樣品細(xì)胞或組織的有效破碎;有效地使白復(fù)合體變性;對內(nèi)源RNA酶的有效抑制;有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離;對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中很關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性。RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑,提取總核酸,再用氯化鋰將RNA 沉淀出來;直接在酸性條件下抽提,酸性下DNA與蛋白質(zhì)進入有機相而RNA 留在水相。種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA 的丟失,目前該方法的使用頻率已很低。PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi),有些很好于當(dāng)日電泳檢測,大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法,故又稱為基因的體外擴增法。PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DN段,并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DN段。因此,PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而較廣地用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域?!‘惓=Y(jié)果: 各種疾病所致的異常,例如梅毒。一期梅毒。即硬下疳 ,潛伏期2-4周,外生殖器部位發(fā)生暗紅色硬腫塊 、淺潰瘍 ,有軟骨樣硬度,周圍淋巴結(jié)腫大。二期梅毒。在一期梅毒 1-2 個月之后,全身皮膚、粘膜發(fā)生對稱泛發(fā)皮疹、斑疹、、疹等。粘膜可發(fā)生粘膜斑、扁平濕疣,傳染性強。三期梅毒。發(fā)生在染上后2-3年乃至10年,皮膚為樹膠樣腫,還可涉及骨、關(guān)節(jié)、心、血管,表現(xiàn)為主動脈炎、主動脈瓣閉鎖不全和主動脈瘤等,侵及神經(jīng)為脊髓癆 ,全身麻痹 ( 麻痹性癡呆 )等等?!⌒枰獧z查的人群:疑似某種特定的疾病病人,進行分子特異性檢查。熱啟動聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以通過將反應(yīng)組分加熱到變性溫度在加入聚合酶之前。南京組織熒光PCR設(shè)計公司
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。寧波血液定量PCR網(wǎng)站
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點:靈敏度高:PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=-6)水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位);在細(xì)菌學(xué)中很小檢出率為3個細(xì)菌。簡便、快速:PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應(yīng)液加好后,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng),一般在2~4 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。純度要求低:不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板??芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴增檢測。寧波血液定量PCR網(wǎng)站