聚合酶鏈式反應準備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴增效率高但易發(fā)生錯配。Pfu擴增效率弱但有糾錯功能。所以實際使用時根據需要必須做不同的選擇。模板即擴增用的DNA，可以是任何來源，但有兩個原則，純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制。緩沖液的成分很為復雜，除水外一般包括四個有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價陽離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價陽離子，即鎂離子，根據反應體系確定，除特殊情況外不需調整；輔助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結構。逆轉錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜，以確定基因的表達或鑒定RNA轉錄物的序列。上海實時RT-PCR檢測技術原理

聚合酶鏈式反應：1976年，中國科學家，發(fā)現了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發(fā)展也做出了基礎性貢獻。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散再調溫度至DNA聚合酶很適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。臺州微量熒光PCRPCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成。

聚合酶鏈反應：流聚合酶鏈反應:一種偽等溫PCR方法。將溶液置于熱梯度下，而不是反復加熱和冷卻聚合酶鏈反應混合物。由此產生的熱不穩(wěn)定性驅動對流流動自動將聚合酶鏈反應試劑從熱區(qū)域和冷區(qū)域打亂，從而反復啟動聚合酶鏈反應。通過利用混沌流場的出現，可以優(yōu)化熱邊界條件和PCR外殼的幾何形狀等參數，以產生特異和快速的PCR。這種對流聚合酶鏈反應設置明顯降低了設備功率需求和操作時間。逆轉錄聚合酶鏈反應(逆轉錄-聚合酶鏈反應):用于從RNA中擴增DNA。逆轉錄酶將核糖核酸逆轉錄成cDNA ，然后通過聚合酶鏈反應進行擴增。逆轉錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜，以確定基因的表達或鑒定RNA轉錄物的序列，包括轉錄起始和終止位點。如果基因的基因組DNA序列是已知的，逆轉錄-聚合酶鏈反應可以用來繪制基因中外顯子和內含子的位置。基因的5’端(對應于轉錄起始位點)通常通過 RACE-PCR (快速擴增cDNA末端)中。

聚合酶鏈式反應準備：PCR引物設計：PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。引物設計的基本原則：引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC很好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。逆轉錄酶將核糖核酸逆轉錄成cDNA ，然后通過聚合酶鏈反應進行擴增。

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：反應緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。引物量過多。減少反應體系中引物的用量。模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。外源DNA污染。確保操作的潔凈。陰性對照出現條帶：試劑，頭，工作臺污染。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔。條帶大小與理論不符：污染。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔。模板或引物使用錯誤。更換引物和模板?；騺喰?。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些很好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。蘇州組織定量PCR網站

聚合酶鏈反應可用于產生突變基因，突變由科學家隨意選擇。上海實時RT-PCR檢測技術原理

PCR的反應條件：Tm=4（G+c）+（A+T），一般在45～55度，溫度低容易退火但特異性低；溫度高，不容易退火但特異性高。退火時間30秒。延伸溫度一般在70～75度這時TaqDNA聚合酶活性很高（150個/S），當引物在16個堿基以下時可采用緩慢升高溫度到70～75度的方法，使在低溫下就開始合成。一般<1KB時間1分鐘即可。當〈1KB時在較后的循環(huán)中延長擴增時間。循環(huán)次數25～30次。無產物時：取10ul擴增混合液作模板在進行PCR擴增；增加TaqDNA聚合酶濃度；增加循環(huán)次數；降低退火溫度；加靶DNA量。上海實時RT-PCR檢測技術原理